Yarrowia lipolytica生物转化γ-癸内酯的研究

【摘要】γ-癸内酯（γ-decalacton，GDL），又名丙位癸内酯，化学名称为γ-正己基丁内酯，天然存在于水果及发酵产品中。GDL因具有诱人的桃香味和低香气阈值，在食用香料及制药、化学合成等领域得到了广泛应用，人们对该产品的需求量日益增大，然而在自然界中尚未发现此香料的大量存在，而化学法生产的却是消旋体。用生物法生产的GDL具有天然等同的特点，目前国际市场也没有天然旋光性GDL产品供应，因此，用生物法生产GDL具有广阔的前景。本论文筛选获得了产GDL的耶鲁维亚解脂酵母（Yarrowialipolytica），以不断提高GDL产量为目标进行了较为系统、完整的研究。采用基因组改组方法提高GDL产量，并对发酵条件进行优化，建立了菌体生长动力学模型和GDL生产动力学模型。为减少底物和产物对细胞的毒性提高GDL产量，以有机复合无机材料制备固定化细胞，提高了细胞的通透性和机械强度，延长了使用寿命。为进一步增加胞内外的物质交换，促进蓖麻油底物进入细胞及GDL产物的泌出，建立了生物转化的离子液体系。通过对影响GDL产量和ACO同工酶酶活因素分析，发现吡啶环具有较好的促进或刺激作用。对照了传统溶剂和超临界二氧化碳萃取法对GDL的提取效果。具体内容有以下几个方面：（1）根据GDL在碱性条件下与盐酸羟胺反应生成中间产物异羟肟酸，异羟肟酸可与三价铁反应生成有色络合物的显色反应原理，建立了准确性和重复性均很好的GDL分光光度检测法，检测范围为：0.125-8.14gL-1。基于该检测方法，建立了96孔微培养板高通量筛选方法，用96孔微培养板培养菌体，再对发酵液进行显色反应，用酶标仪检测吸光度，最终从4327个样本中，获得了215株产GDL菌株，其中产量最高为179mgL-1，经26SrRNA测序结果，该菌株确定为Yarrowialipolytica。（2）以紫外诱变获得的正向突变株作为基因组改组的出发菌库，获得了原生质体制备和融合的最佳条件，采用递推式融合法，经过三轮融合，获得了产量最高且遗传稳定性较好的菌株G3-3.21，产量为3.75gL-1，是出发菌株的6.58倍。通过对正向突变株ACO酶活和GDL产量的比对分析，发现GDL的高产不仅要求ACO同工酶对长链底物降解能力较强，还需对中链和短链底物的降解偏弱，才有利于GDL的累积且能够在一定时间内维持此最高产量，不会在短时间内未来得及内环化又被进一步β-氧化了。（3）为提高GDL产量，采用田口设计法对8个因素进行优化，确定主要影响因素为麸皮、复合氮源和初始pH。然后采用响应面分析法对主要影响因素进一步优化，获得最优发酵条件，GDL产量达到4.767g·L-1。麦麸中烟酸的吡啶环对于GDL的生产可能有较好的促进作用。对Z703和G3-3.21的菌体生长动力学和产物形成动力学进行研究，其菌体生长模型分别为dXdd=0.309(1Xt15.2)X和XXdt=0.438(116.7)X，GDL生成动力学模型分别是dPdPdt=0.00105X和dt=0.00784X。（4）为减少底物和产物对细胞的毒性，采用固定化细胞转化技术，为提高通透性和机械强度，采用有机海藻酸钠复合无机凹凸棒石粘土固定化细胞，GDL产量达6.15gL-1，比游离细胞高1.32倍，且可重复使用3次。构建了生物相容性较好的离子液转化体系，增加了胞内外的物质交换，GDL产量达7.85g·L-1。与相同的阴离子相比，当阳离子为吡啶离子时，GDL产量和ACO酶活普遍高于咪唑离子；当阴离子为溴离子和硝酸离子时，GDL产量和ACO酶活均低于阴离子为四氟磷酸离子和六氟磷酸离子。（5）研究了游离细胞的破壁条件，对照未破壁发酵液，GDL产量提高14.06%。通过酸化和加热实验，证明本研究中所采用的耶氏酵母本身就具有内酯化能力，不需在萃取前，通过加热酸化将前体物4-羟基-癸酸人工内酯化成GDL。研究了固定化细胞离子液体系生物转化GDL的提取工艺，采用乙酸丁酯萃取法，萃取率最高达86.2%；采用超临界二氧化碳的最佳萃取率为91.7%。
【作者】赵玉萍；
【导师】徐岩；
【作者基本信息】江南大学，发酵工程，2014，博士
【关键词】Yarrowialipolytica；γ-癸内酯；高通量筛选方法；基因组改组；固定化细胞；离子液体；

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