改良人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中分泌表达的研究

【摘要】毕赤酵母能够在高效表达外源蛋白的同时，对外源蛋白进行翻译后的正确折叠和加工修饰，已成为目前表达外源蛋白尤其是人源药物蛋白所广泛采用的表达宿主之一。然而随着越来越多外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达，发现某些外源蛋白在分泌表达过程中存在胞内聚集而导致分泌表达量较低，宿主蛋白酶对外源蛋白存在不同程度的降解等问题。本研究室前期研究结果也表明，采用相同的载体和宿主表达系统，在各自优化后的培养和表达条件下，多种人血清白蛋白(HSA)融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量较HSA显著降低，分泌表达过程中HSA融合蛋白降解较严重，对表达产物的后期纯化带来了相当的困难。基于毕赤酵母存在的以上不足，本论文通过基因工程的手段，从以下三个方面对已有HSA融合蛋白的毕赤酵母分泌表达系统进行了改造：1、为避免诱导碳源甲醇对发酵制备HSA融合蛋白可能带来的不利影响，以毕赤酵母GS115作为出发菌株，成功构建筛选获得一株甘油醛3-磷酸脱氢酶基因启动子(PGAP)调控的分泌表达rhIL-2-HSA融合蛋白的菌株。该菌株能在多种单一碳源的培养基中组成型分泌表达rhIL-2-HSA融合蛋白。以葡萄糖为碳源时，rhIL-2-HSA融合蛋白的表达量最高。5L罐发酵实验结果显示，rhIL-2-HSA融合蛋白的PGAP表达菌株，在以葡萄糖为单一碳源的发酵培养基中发酵60h，rhIL-2-HSA融合蛋白的表达量可达约250mg·L-1。由此纯化获得的rhIL-2-HSA融合蛋白的体外活性约为1.040×106IU·mg-1，与甲醇诱导型的PAOX1表达系统获得的rhIL-2-HSA融合蛋白的体外活性水平相当。2、为促进HSA融合蛋白的分泌表达，选择折叠酶PDI、Ero1、分子伴侣BiP、以及囊泡转运过程参与调控膜融合的SM蛋白Sec1和Sly1作为分泌辅助因子进行共表达，并分析共表达以上分泌辅助因子对rhIL-2-HSA融合蛋白分泌表达的影响。共表达分泌辅助因子PDI、Ero1、BiP、Sec1和Sly1对分泌表达融合蛋白rhIL-2-HSA菌株的正常生长没有影响，分别使融合蛋白rhIL-2-HSA的分泌表达量提高了120%,130%,90%,150%和90%。Westernblot对共表达PDI，Ero1，BiP，Sec1和Sly1的各个共表达菌株细胞内胞质蛋白组分和膜偶联蛋白组分进行半定量发现，胞质蛋白组分和膜偶联蛋白组分中rhIL-2-HSA融合蛋白的含量也显著增加。定量PCR分析发现，共表达菌株中相关分泌辅助因子的基因转录也显著增强。3、为了减少HSA融合蛋白在分泌表达过程中的降解，以毕赤酵母GS115菌株为亲本菌株，分别敲除毕赤酵母各个Yapsin蛋白酶编码基因YPS1，YPS2，YPS3，MKC7和YPS7，构建了毕赤酵母单基因敲除菌株Yps1Δ，Yps2Δ，Yps3Δ，Mkc7Δ，Yps7Δ和多基因敲除菌株GBD2，GBD3，GBD4，GBD5。将融合蛋白HSA-ADAM15的表达载体转入以上构建的单基因敲除菌株，发现敲除单个Yapsin蛋白酶基因YPS1，YPS2，YPS3，MKC7或YPS7，对融合蛋白HSA-ADAM15分泌表达时的降解没有明显改善。在多重Yapsin蛋白酶基因敲除菌株GBD4(yps1Δyps2Δyps3Δ)和GBD5(yps1Δyps2Δyps3Δyps7Δ)中分泌表达HSA-ADAM15融合蛋白，HSA-ADAM15的降解得到部分缓解：GBD4菌株表达的完整目标蛋白含量约为对照GS115菌株中的133%，降解片段d1和d2的含量则分别降低了50%和52%。这表明多个Yapsin蛋白酶缺陷的毕赤酵母菌株能够部分缓解分泌表达过程中融合蛋白HSA-ADAM15的降解。此外，对各个蛋白酶缺陷菌株的生长表型进行分析，发现在获得的蛋白酶缺陷菌株中，Yps7Δ菌株对CalcofluorWhite，刚果红和SDS三种细胞壁胁迫性物质的抗性增强。与GS115菌株相比，Yps7Δ突变体细胞侧生细胞壁(lateralcellwall)部分的几丁质含量降低,β-1,3-葡聚糖含量则显著增加。透射电镜观察也发现Yps7Δ突变体细胞壁中由β-1,3-葡聚糖组成的细胞壁内层结构厚度也显著增加，表明毕赤酵母的Yps7参与细胞壁组分合成的调控。生长表型分析还发现，Yps7Δ菌株对由KCl和NaCl引起的渗透胁迫也表现出显著增强的抗性。渗透胁迫条件下，Yps7Δ菌株自身胞内甘油积累量显著高于GS115菌株的积累量，表明毕赤酵母的Yps7还参与渗透胁迫响应的调控。
【作者】关波；
【导师】李华钟；
【作者基本信息】江南大学，发酵工程，2014，博士
【关键词】人血清白蛋白；融合蛋白；毕赤酵母；组成表达；分泌表达；蛋白酶；基因敲除；

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