重组人白介素24在大肠杆菌中的高效表达及其抗肿瘤应用
【摘要】P.B.Fisher等人在细胞表面受体Mda-7发现的基础上，鉴定了黑素瘤分化相关蛋白-7（MDA-7），随后MDA-7被重命名为IL-24。IL24属于IL-10细胞因子家族成员，该家族包括IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24和IL-26。IL-24具有抑制多种人类癌细胞生长的特性，同时对正常细胞无诱导危害。IL-24具有潜在的治疗应用价值并在肿瘤细胞学领域起着重要作用。重组人源IL-24（rhIL-24）最初是使用Escherichiacoli进行生产并利用传统方法进行纯化鉴定，其发酵策略是基于LB培养基的分批培养，然后利用高压均质机来裂解细胞。在E.coli中表达真核生物蛋白会导致不溶性的包涵体（IBs）的形成。对活性治疗性蛋白生产来说，包涵体的溶解和重折叠是一个关键挑战。传统的包涵体溶解和重折叠方法纯化应用于小体积的样品，使用阴离子和阳离子交换色谱法从样品中取出杂质，从而得到纯化的产品。这种传统的rhIL-24制备方法被认为是一个耗时、费力的过程。本文设计了一种基于传统方法的高效、低成本的rhIL-24制备策略。培养基的成本和组成对于商业规模的E.coli重组蛋白生产至关重要，采用向培养基中添加酵母提取物、葡萄糖等成分提高rhIL-24的产量；同时，用乳糖替代IPTG的使用，也降低了成本和毒性。此外，我们用一种2步变性-重折叠法（2DR）替代传统的重折叠法，从而提高了rhIL-24的产量。新的制备策略使得高质量、高纯度的rhIL-24获得过程更加简单，同时，LC-MS/MS技术的运用为rhIL-24提供了精确的定性、定量信息。一步纯化的rhIL-24被作为癌症和多药耐药肿瘤细胞的有效的治疗剂进行相关分析。rhIL-24在肝癌细胞系HepG2显示了生物活性，但是对L02细胞没有影响。膜上的P-糖蛋白（P-gp）是多药耐药的主要因素。我们研究了rhIL-24对抗阿霉素（ADM）人源乳腺癌细胞系MCF-7/ADM的影响，利用MTT法对rhIL24和ADM的细胞毒性进行了检测，P-gp的表达用显微共聚焦法和Westernblot法分析评估，ADM在MCF-7/ADM细胞系中的IC50在加入rhIL-24后呈现剂量依赖性降低。在低剂量的rhIL-24（(4μPol·L-1)）的MCF-7/ADM细胞系中，ADM积累增加，而P-gp的表达降低。体外生物活性表明，rhIL-24通过激活Stat3转录因子绕过MCF-7/ADM细胞的多药耐药，rhIL-24可以作为P-糖蛋白的抑制剂，用以逆转乳腺癌细胞的阿霉素抗性。本研究的最终目标是将rhIL-24作为可控释放药物。基于干细胞的基因治疗方案，受限于IL-24到皮下肿瘤的转运。腺病毒介导的mda-7/IL-24(Ad.mda-7)法会导致过度表达引起细胞生长停滞和凋亡。在病毒载体相比，非病毒载体系统具有毒性低，生物相容性，可控性。非病毒载体与药物的共轭聚合物可以显著增加药物的水溶性，改性的组织分布和血浆循环半衰期。蛋白质-PEG复合物已能通过增加药物的稳定性显著提高疗效。本研究开发的策略，产生一个均匀的、单体嵌合的rhIL-24和PEG鱼精蛋白复合物。PEG鱼精蛋白-IL24纳米颗粒能够确认对MCF-7／ADM细胞活性。PEG修饰的鱼精蛋白–rhIL-24纳米颗粒具有无可比拟的疗效。目前的研究对一种rhIL-24控释制剂的临床实现铺平了道路。
【作者】MuhammadImranAmirzada；
【导师】金坚；
【作者基本信息】江南大学，发酵工程，2014，博士
【关键词】细胞因子；发酵；纯化；多药耐药；纳米颗粒；
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