以秀丽隐杆线虫筛选抑制产肠毒大肠杆菌的益生菌及其作用机理

【摘要】产肠毒素性大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiaE.coli，ETEC)是一类引起人和幼畜(初生仔猪、犊牛等)腹泻的主要病原菌。近年来，控制ETEC的抗生素的滥用导致耐药性人畜共患细菌病原体的出现，对公众健康已经构成威胁。益生菌制剂因其安全无毒副作用已经逐渐取代抗生素应用到生产中。益生菌的益生作用除了控制肠道致病菌之外，还能改善肠道菌群，调节宿主免疫。但是如何从大量的微生物中筛选出我们所需要的有特定益生功能的益生菌是现在益生菌研究面临的主要问题之一。体外模型筛选虽然方便快捷，但是与体内环境差异大，而动物模型个体差异较大，成本昂贵，所耗的人力、物力较大。因此，从研究成本、技术可行性和应用前景考虑，结构简单，繁殖时间短，遗传信息清楚，免疫防御系统高度保守，已被广泛动物模型系统研究病理、神经学、细胞生物化学及药物反应过程等诸多方面的秀丽隐杆线虫可以作为潜在的动物模型筛选有特定益生作用的乳酸菌。在本文的研究中，建立了ETECJG280致死线虫模型，以及保护线虫抵抗ETECJG280的乳酸菌快速筛选模型，并利用快速筛选模型挑选出保护效果最好的一株玉米乳杆菌LB1；研究玉米乳杆菌LB1保护线虫的机理包括对ETECJG280以及宿主的作用，最后对线虫模型和体外细胞模型筛选乳酸菌以及研究其益生机理进行了比较。论文的主要结果如下：(1)建立了ETECJG280感染线虫模型，并以此为基础筛选能保护线虫的益生菌，建立益生菌快速筛选模型。用于筛选的13株菌对线虫有不同程度的保护效果，其中玉米乳杆菌LB1保护效果最好，线虫的存活率达到78%，罗伊氏乳杆菌CL11保护效果不显著，线虫的存活率仅有23%，其余菌株的保护效果在23%-78%之间。保护线虫效果最显著的玉米乳杆菌LB1的耐酸耐胆盐能力也较强，而保护线虫能力较差的菌株罗伊氏乳杆菌CL11的耐酸耐胆盐能力也不理想，其它菌株的耐酸和耐胆盐能力之间没有相关性。因此保护线虫能力和耐酸耐胆盐能力均较强的玉米乳杆菌LB1可以作为潜在的益生菌进一步研究其保护机理。(2)益生菌抑制致病菌起保护宿主的作用主要是两方面因素。一方面是由于抑制致病菌的生长，减少致病菌的定植；另一方面是降低致病菌毒素对宿主的毒害作用。通过透射电镜确定乳酸菌和ETECJG280均能在线虫肠道定植，并且将线虫破碎后稀释涂平板的方法研究益生菌和致病菌在线虫体内的定植情况，发现乳酸菌的定植数量和致病菌ETECJG280无显著差异，都在104CFU/mL左右，保护效果不同的玉米乳杆菌LB1和罗伊氏乳杆菌CL11的定植数量无显著差别，并且两株乳酸菌对于ETECJG280的定植数量没有影响。因此乳酸菌LB1对线虫的保护作用与抑制ETECJG280的定植无关。此外，通过对ETECJG280的3个主要肠毒素基因进行克隆研究ETECJG280对线虫致死作用和其肠毒素基因之间的关系。结果表明3个肠毒素中，STa和STb对线虫的致死作用和ETECJG280相当，LT的致死作用显著低于ETECJG280。通过将线虫和玉米乳杆菌LB1共培养18h后再加入致病菌ETECJG280的方法研究了玉米乳杆菌LB1对ETECJG280毒素的影响，发现玉米乳杆菌LB1可以显著降低ETECJG280毒素基因表达，并可以大大降低毒素的致死作用。综合本实验结果表明玉米乳杆菌LB1对线虫的保护作用和抑制ETECJG280肠毒素有关。(3)通过比较对线虫保护效果有差异的乳酸菌LB1和CL11对线虫防御基因表达的影响可以发现，玉米乳杆菌LB1能显著提高MAPK和DAF-16信号通路中关键基因及抗菌肽基因的表达，而乳酸菌CL11及灭活的玉米乳杆菌LB1对防御基因表达影响较小，说明仅有活的玉米乳杆菌LB1才能发挥保护作用影响线虫免疫防御机制。当线虫中MAPK信号通路关键基因nsy-1，sek-1，pmk-1被敲除以及Daf-2/Daf-16信号通路关键基因daf-16被敲除后，线虫抵御ETECJG280致死能力显著降低，说明这两条通路是线虫防御ETEC侵袭的重要通路。通过分析nsy-1基因缺陷型线虫和daf-16基因缺陷型线虫中抗菌肽基因的表达，发现抗菌肽基因abf-2，clec-85，lys-7，clec-60受nsy-1和daf-16基因调控，spp-1只受daf-16基因调控，而abf-3不受任何这两条信号通路的调控。和玉米乳杆菌LB1共培养18h能显著提高age-1基因缺陷型线虫，dbl-1基因缺陷型线虫，抗氧化基因sod-3基因缺陷型线虫以及skn-1基因缺陷型线虫的存活率，却不能提高nsy-1基因缺陷型线虫，sek-1基因缺陷型线虫，pmk-1基因缺陷型线虫，daf-16基因缺陷型线虫，以及部分抗菌肽spp-1，abf-3，lys-7基因缺陷型线虫的存活率。并且玉米乳杆菌LB1能显著提高age-1基因缺陷型线虫和dbl-1基因缺陷型线虫中抗菌肽基因表达，却对nsy-1基因缺陷型线虫，daf-16基因缺陷型中抗菌肽的表达没有影响。由此可见，乳酸菌可能是通过MAPK和DAF-16信号通路控制的抗菌肽基因来发挥其保护作用的。(4)通过比较线虫模型和体外细胞模型筛选乳酸菌拮抗ETEC发现，CL9，K16，K67，S33，LB1这5株乳酸菌在两个模型中保护效果均较好，CL10，CL11，CL12，K30，S20这5株菌在两个模型中都属于保护效果不佳的乳酸菌，剩余4株菌K67，S8，S64，S65在两个模型中表现差异较大。相关性分析显示，这些乳酸菌在两个不同模型中的保护效果相关性显著R=0.61(P<0.0001，N=42)。总体而言，14株乳酸菌在两个模型中保护效果类似。进一步选取在两个模型中保护效果均最好的罗伊氏乳杆菌CL9，比较它在两个模型中对ETEC肠毒素基因，肠毒素基因克隆以及宿主免疫调节的作用。结果显示，罗伊氏乳杆菌CL9在两个模型中对宿主的保护机理类似，都能抑制肠毒素基因的表达，显著减少肠毒素克隆的致死作用。
【作者】周梦舟；
【导师】陈永泉；
【作者基本信息】江南大学，食品科学，2014，博士
【关键词】益生菌；秀丽隐杆线虫；产肠毒性大肠杆菌；肠毒素基因；秀丽隐杆线虫免疫防御基因；

【参考文献】
[1]周希伦.基于PMU信息的电网故障定位研究[D].中国矿业大学,电力系统及其自动化,2014,硕士.
[2]张瑶,郭雪萌.风险管理视角下对企业内部控制评价研究[J].理论与改革,2015,01:86-90.
[3]耿静漪.负载型二氧化钛光催化降解染料的研究[D].苏州大学,纺织材料与纺织品设计,2012,硕士.
[4]余方兴.加权关联规则优化算法研究[D].华中师范大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[5]张玉超.甲醛暴露对小鼠造血系统转录因子及骨髓组织毒性效应的研究[D].华中师范大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[6]江涛,刘金民,王玉来,尹岭,唐大晅.建立中西结合脑病数据库的探索[J].中医药学刊,2005,02:252-254.
[7]邬伟东.瑞芬太尼在围手术期临床应用的研究[D].浙江大学,外科学,2004,硕士.
[8]吴晓雁.科尔沁人的葬礼中的宗教信仰意识[D].内蒙古师范大学,宗教学,2013,硕士.
[9]段大坤.双馈变流器检测系统故障诊断与容错控制研究[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2014,硕士.
[10]周强.基于物联网的智能心音检测与分析系统的研究[D].兰州理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[11]魏远明.柔性臂末端跟踪的滚动窗口非因果稳定逆控制[D].浙江大学,控制科学与工程,2014,硕士.
[12]周阳.海洋定点监测升降式浮标控制系统研制[D].杭州电子科技大学,电路与系统,2013,硕士.
[13]刁辉.东汉汉羌关系研究[D].扬州大学,中国古代史,2012,硕士.
[14]金涌中国工程院院士清华大学教授.创新是科学家、工程师和能工巧匠共同的事[N].文汇报,2014-11-28006.
[15]傅静.香格里拉之声传播策略研究[D].云南师范大学,新闻学,2013,硕士.
[16]郭文斌,方俊明.我国ASD者面孔识别研究热点知识图谱[J].心理与行为研究,2014,04:490-495.
[17]赵友平,张静,李金兴,谈振辉.基于改进射线跟踪法的隧道环境无线信道仿真[J].北京交通大学学报,2014,05:12-18.
[18]雷勇.激发作者的创作潜能[D].上海大学,文艺学,2013,硕士.
[19]周厚诚,任海,彭少麟.广东南澳岛植被恢复过程中的群落动态研究[J].植物生态学报,2001,03:298-305.
[20]陈洁.对外汉语虚词教学策略探析[D].华中师范大学,对外汉语教学,2013,硕士.
[21]张晓亮.安守记故意伤害案案例分析[D].兰州大学,刑法学（专业学位）,2013,硕士.
[22]左志高.太赫兹相干层析成像及相关功能器件研究[D].华中科技大学,2013.
[23]尹永强,胡建斌,邓明军.植物叶片抗氧化系统及其对逆境胁迫的响应研究进展[J].中国农学通报,2007,01:105-110.
[24]高霆.上市公司高管团队内部薪酬差异对公司绩效影响的实证研究[D].辽宁大学,企业管理,2012,硕士.
[25]毕大强,王祥珩,李德佳,余高旺,王赞基,王维俭.变压器和应涌流的理论探讨[J].电力系统自动化,2005,06:1-8.
[26]刘贝.明日叶查尔酮对2型糖尿病大鼠肝细胞胰岛素信号转导分子mRNA表达的影响[D].青岛大学,卫生毒理学,2013,硕士.
[27]王琴.电解液添加剂对新型铅粉制备电池性能影响的研究[D].华中科技大学,环境工程,2013,硕士.
[28]彭自成,郑吉春.行业科技型大学提升服务社会能力的战略选择[J].中国高校科技,2014,08:64-67.
[29]朱占忠.汉字的视觉语言在文化招贴中的应用研究[D].西南交通大学,设计艺术学,2013,硕士.
[30]范双文.基于凝聚力的虚拟社区特征对社区绩效的影响研究[D].浙江大学,2008.
[31]陈程.中学生地理信息素养培养研究[D].华中师范大学,学科教学,2013,硕士.
[32]张倩.论我国动物保护法的建立[D].兰州大学,民商法学（专业学位）,2013,硕士.
[33]冯锡光.经皮穿刺椎间盘臭氧消融术的临床应用研究[D].暨南大学,骨外科,2013,硕士.
[34]石航.列车组融冰防冰技术研究[D].华中科技大学,机械工程,2013,硕士.
[35]韩春.西安市城镇化质量及其协调性发展实证研究[D].吉林大学,社会医学与卫生事业管理,2013,硕士.
[36]王艺平.现代建筑创作中的轴线应用研究[D].合肥工业大学,建筑设计及其理论,2004,硕士.
[37]胡落.非指导性教学方法在小学语文教学中的运用研究[D].华中师范大学,小学教育,2013,硕士.
[38]王红梅.中国古代诗学中心物关系论的形成与发展[D].延安大学,文艺学,2014,硕士.
[39]陆妍.我国股票型开放式基金的相对绩效分析与评价[D].苏州大学,金融（专业学位）,2014,硕士.
[40]何彤宇.基于分布式数据库的网络教学资源系统设计与研究[D].贵州师范大学,2004.
[41]朱塔娜.论个人信息的民法保护[D].吉林大学,法律,2012,硕士.
[42]刘学成.香豆素衍生物的合成及其性质研究[D].苏州大学,有机化学,2014,硕士.
[43]刘刚.基于IT的制造业生产作业联盟研究[D].哈尔滨工程大学,2003.
[44]孙锐1贾眀2孙蕾2.世界无花果资源发展现状及应用研究[J].世界林业研究,2015,:.
[45]王鹏.铜镀金触点材料微动磨损实验及其失效物理分析[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2013,硕士.
[46]孙正.主题自适应学术会议搜索系统[D].华中科技大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[47]张岩.滨海新区零售商业网点优化布局研究[D].天津大学,公共管理,2013,硕士.
[48]蔡永萍.不同辣椒品种果实成分对棉铃虫和烟夜蛾下唇腺特异基因表达的影响[D].河南农业大学,农业昆虫与害虫防治,2012,硕士.
[49]张丹丹.煤化工废水生化处理后二沉池出水回用的腐蚀特性研究[D].哈尔滨工业大学,环境科学与工程,2014,硕士.
[50]林立娜.乡土文化资源在《文化生活》教学中的运用研究[D].河北师范大学,教育,2013,硕士.