一步单菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸工程菌的构建与优化

【摘要】2-酮基-L-古龙酸（2-keto-L-gulonicacid）是合成维生素C的重要前体。目前国内维生素C生产采用二步发酵法，该过程工艺复杂，影响因素较多，难以精确控制，同时3种微生物生长消耗了大量的原材料和能源。如能以D-山梨醇为碳源进行一步发酵生产维生素C前体2-KLG，对于维生素C产业将是具有重大意义的技术进步。本论文利用基因工程技术将维生素C二步发酵有关基因分别表达于大肠杆菌（Escherichiacoli）和氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）中，构建一步发酵工程菌生产2-KLG，并通过不同连接肽的选择、提高辅酶吡咯喹啉醌（pyrroloquinolinequinine，PQQ）供给以及利用耐热交联蛋白CutA作为蛋白支架等策略，有效提高了G.oxydans一步工程菌生产2-KLG的产量，实现了由D-山梨醇经单菌一步发酵生产2-KLG。主要研究结果如下：（1）2-KLG合成关键基因的克隆与鉴定根据KetogulonicigeniumvulgareWSH-001基因组注释，得到7个与2-KLG合成途径相关的关键脱氢酶。为了验证关键酶的酶学性质，将其分别在E.coli中进行了表达与纯化。测定酶活发现7个脱氢酶均为PQQ依赖性的醌酶，KVU1366、KVU0203、KVU2142、KVU2159及KVUPA0245同时具有SDH及SNDH的活性，其中KVU2142具有最高的比酶活为9.68U/mg。而KVUPB0115及KVU0095仅具有SNDH活性，后者比酶活为前者的近两倍。体外催化能力的测定表明，将酶液与PQQ孵育5min形成全酶后，5个SDH/SNDH单独及分别与2个SNDH组合催化L-山梨糖均能够生成2-KLG，其中KVU2142与KVU0095组合生成2-KLG的浓度最高，为19.7g·L–1。（2）分子改造大肠杆菌一步发酵生产2-KLG考察了高浓度的2-KLG对E.coli生长的影响，发现高达100g·L–1的2-KLG对E.coli的生长没有明显的抑制作用。另外，在添加2-KLG的条件下进行E.coli的培养，在发酵120h后未检测到2-KLG的降解，表明E.coli可以作为一步发酵生产2-KLG工程菌构建的宿主。利用具有相容性的两个质粒pETDuet-1及pRSFDuet-1成功构建了一步工程菌株E.coli/pET-k2142-k0095-pRSF-sldh-pqq。通过SDS-PAGE检测及体外催化反应表明，KVU2142、KVU0095、sldh及pqqABCDE在E.coli中得到了表达。将一步工程菌经过72h发酵后检测到有4.8g·L–1的山梨糖及0.5g·L–1的2-KLG生成，大部分山梨醇转化成了副产物。经过分析，山梨醇可能是通过山梨醇磷酸转移酶系统进入了糖酵解和磷酸戊糖途径。（3）氧化葡萄糖酸杆菌全基因组测序及基因操作系统的构建通过高通量Illumina测序技术得到一个全长为3,364,884bp的G.oxydansWSH-003基因组，共编码3705个ORF，G+C含量为50.42%。G.oxydansWSH-003中涉及碳水化合物代谢的基因共约330个，另外存在300多个膜转运蛋白，使其具有很高的不完全氧化能力和转化效率。考察了高浓度的2-KLG对G.oxydansWSH-003的生长的影响。结果表明，高达100g·L–1的2-KLG对G.oxydansWSH-003的生长没有明显的抑制作用。另外，在添加2-KLG的条件下进行G.oxydansWSH-003的培养，在发酵120h后未检测到2-KLG的降解，表明G.oxydansWSH-003可以作为一步发酵生产2-KLG工程菌构建的宿主。选择G.oxydans621H包含的质粒pGOX3中的复制起始位点序列克隆到E.coli克隆载体pUC18中，得到E.coli-G.oxydans穿梭质粒载体pGUC，该载体具有较高的转化效率并且在没有抗性选择压力的条件下也具有很高的稳定性。（4）氧化葡萄糖酸杆菌工程菌的构建及利用连接肽工程与辅因子工程对一步工程菌的改造将来源于K.vulgareWSH-001的5个SDH/SNDH基因和2个SNDH基因分别以不同的组合构建了10株工程菌，经摇瓶发酵均检测到2-KLG的生成，其中G.oxydans/pGUC-k0203-k0095的产量最高，为4.9g·L–1。选择了不同种类及长度的连接肽将k0203和k0095进行融合构建得到10株融合表达工程菌，发酵168h后，2-KLG产量最高达到31.2g·L–1。继续考察了酵母粉浓度对发酵产量的影响，确定酵母粉最佳浓度为10g·L–1，发酵168h后2-KLG产量为32.4g·L–1。在融合表达一步工程菌的基础上进一步表达pqqA和pqqABCDE提高辅酶供给，表达了pqqA和pqqABCDE的两株工程菌PQQ含量较野生菌分别提高了63.2%和136.5%。发酵168h后2-KLG产量分别达到35.1g·L–1和39.2g·L–1，较融合表达最高产量分别提高了8.3%和21.0%。（5）基于耐热交联蛋白CutA对氧化葡萄糖酸杆菌一步工程菌的改造首先对k0203-GGGGS-k0095进行了密码子优化，得到工程菌的2-KLG产量为33.2g·L–1。随后对来源于掘越氏热球菌（Pyrococcushorikoshii）的cutA进行密码子优化后在G.oxydans中进行了表达。结果表明CutA在G.oxydans中的表达提高了G.oxydans的耐热性。将优化后的cutA与k0203-GGGGS-k0095在G.oxydans中进行了共表达，得到的一步工程菌生成2-KLG的产量达到40.3g·L–1，较未表达CutA的工程菌提高了24.4%。对基于CutA构建的一步工程菌进行了30℃、35℃及37℃条件下的发酵，结果表明表达了CutA的工程菌生产2-KLG的产量在3个温度条件下均高于对照菌，但是在35℃及37℃条件下，2-KLG的产量均明显下降。最后在表达CutA工程菌的基础上进一步表达了pqqABCDE来提高辅酶供给，发酵168h后2-KLG产量达到42.6g·L–1。
【作者】高丽丽；
【导师】陈坚；
【作者基本信息】江南大学，发酵工程，2014，博士
【关键词】2-酮基-L-古龙酸；脱氢酶；连接肽；耐热交联蛋白；吡咯喹啉醌；

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