Pseudomonas putida高效催化合成烟酸/异烟酸及其腈水解酶的分子克隆

【摘要】微生物腈水解酶作为腈水解酶家族重要的一员，能催化具有毒性的腈类化合物转化为羧酸，被广泛应用于制备医药、农药中间体和生产精细化工品等领域。与传统化学方法相比，腈水解酶催化腈类化合物制备羧酸具有反应条件温和、产率高、选择性高、环境友好、污染物少等特点。本实验室从土壤中分离到一株高产腈水解酶的细菌，鉴于该菌株所表现的催化潜力，本文针对其产酶条件、全细胞催化特征进行了考察，并将野生酶进行了分离纯化，在此基础上开展了腈水解酶的基因克隆及表达等工作。本文利用3-氰基吡啶为唯一氮源，从土壤中分离筛选到一株具有高腈水解酶活性的细菌，能高效转化3-氰基吡啶为烟酸。通过形态学特征、生理生化试验和16SrRNA基因序列(GenBankNo.JQ086574)及系统发育分析，该菌株鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，命名为P.putidaCGMCC3830。P.putidaCGMCC3830静息细胞能将3-氰基吡啶完全转化为烟酸，无任何副产物生成。为了充分挖掘该菌株的产酶潜能，对P.putidaCGMCC3830产腈水解酶发酵条件进行了优化。通过单因素法和响应面法优化实验，确定P.putida产腈水解酶的最佳培养基组分为(g·L-1)：甘油13.54、胰蛋白胨11.59、酵母粉5.21、KH2PO41、NaCl1、尿素1；最佳培养条件为：培养基初始pH6.0，培养温度30℃，装液量55mL/250mL，培养时间36h。经过优化，腈水解酶酶活大幅度提高，从2.02U·mL-1升至36.12U·mL-1。研究了环境因素对P.putidaCGMCC3830全细胞催化反应的影响。结果表明，P.putida最适反应pH为7.2-7.8，最适反应温度为45℃。P.putida全细胞在30℃、35℃、40℃、45℃的腈水解酶活性半衰期(t1/2)分别为78.9h、45.2h、29.6h、15.0h。P.putida催化活性受到Hg2+、Ag+、Al3+的强烈抑制。向反应体系中添加各种表面活性剂对活性无显著影响。P.putida对多种腈类化合物具有水解能力，尤其对3-氰基吡啶和4-氰基吡啶的转化能力较高。3mgcdw·mL-1的细胞能在20min内将100mmol·L-1的3-、4-氰基吡啶完全转化。采用批次补料的方式转化3-、4-氰基吡啶，经过330min的反应累积获得147g·L-1的烟酸；经过380min反应累积获得172g·L-1的异烟酸。此研究为P.putida的工业生物催化应用奠定了基础。建立了P.putidaCGMCC3830腈水解酶纯化方法。采用硫酸铵分级沉淀、Butyl-sepharose疏水层析、Q-Sepharose离子交换层析、SuperdexTM200凝胶过滤层析逐步分离获得了电泳纯的腈水解酶。整个纯化过程最终回收率为17.1%，纯化倍数为18.1，纯化酶比酶活54.4U·mg-1。采用凝胶柱和SDS-PAGE测定纯化酶相对分子质量，结果表明此酶是一个相对分子质量为307kDa的同源寡聚蛋白，由8个相对分子质量为41kDa的亚基组成。通过双向电泳测得纯化酶的等电点为5.2。纯化酶N端经测序为MVTYTNKFXAA。为进一步了解腈水解酶的催化特性，对P.putidaCGMCC3830纯化腈水解酶进行酶学表征。酶最适pH为7.5，最适温度为40℃。金属离子对酶活均无促进作用，活性受到巯基结合金属离子Ag+和Hg2+以及巯基抑制剂N-乙基顺丁烯二酰亚胺和碘乙酰胺的抑制。金属离子螯合剂EDTA和8-羟基喹啉对酶活无显著影响。还原剂DTT、L-半胱氨酸、L-谷胱甘肽对酶活无显著影响，巯基乙醇和抗坏血酸对酶活有抑制作用。纯化酶能转化多种腈类化合物，尤其对芳香腈类化合物如3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和2-氯-4氰基吡啶水解能力较高，根据分类学定义将该酶归为芳香腈水解酶类。酶以3-氰基吡啶为底物的动力学参数Km、Vmax分别为27.9mmol·L-1和84.0U·mg-1。对P.putidaCGMCC3830腈水解酶基因进行了克隆和序列分析。采用CODEHOPPCR、简并PCR和TAIL-PCR获得P.putidaCGMCC3830腈水解酶基因。基因由1113bp碱基组成，共编码370个氨基酸，理论分子量和等电点分别为40.9kDa和5.25。基因和氨基酸序列与其他各类已报道的微生物腈水解酶同源性均低于64%。构建腈水解酶系统进化树，发现P.putidaCGMCC3830腈水解酶与玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)J1和R.rhodochrousNCIMB11216芳香腈水解酶位于同一亚分支。对P.putidaCGMCC3830腈水解酶进行异源表达及分离纯化。将腈水解酶基因与pET28a(+)连接后转入大肠杆菌(Escherichiacoli)Rosetta-gami(DE3)进行表达。重组菌表现出较好的腈水解酶活性，以3-氰基吡啶为底物时酶活可达到10U·mL-1。3mg·mL-1的重组菌静息细胞可在10min内将100mmol·L-1的3-、4-氰基吡啶完全转化为相应的烟酸和异烟酸。通过Ni-NTA亲和层析纯化获得重组纯化酶，以3-氰基吡啶为底物，在反应pH为7.5、温度为30℃条件下，重组纯化酶比酶活为48.8U·mg-1。
【作者】朱小燕；
【导师】许正宏；
【作者基本信息】江南大学，发酵工程，2014，博士
【关键词】腈水解酶；Pseudomonasputida；产酶条件优化；分离纯化；克隆表达；

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