葡聚糖酶在蔗糖生产过程中的应用研究

【摘要】在制糖过程中,葡聚糖是最主要的杂质之一。葡聚糖因影响蔗糖结晶而导致蔗糖损失,给蔗糖加工和精制增加了难度,并造成经济损失。因此,近年来很多研究采用微生物降解法降低制糖过程中葡聚糖的分子量,从而使葡聚糖对蔗糖加工影响最小化。到目前为止,葡聚糖酶降解法是糖加工厂和精炼厂用来水解葡聚糖最有效的方法。本论文的主要目的包括：(1)优化蔗糖生产过程中葡聚糖酶的添加条件(2)研究葡聚糖酶降解葡聚糖对蔗糖结晶过程和糖晶体的影响(3)探索改善葡聚糖酶活性以减少工业应用成本的新方法。研究了不同分子量和不同浓度的葡聚糖对过饱和蔗糖溶液的流变和玻璃化转变特性的影响。分别将三种分子量葡聚糖100000g/mol、500000g/mol、2000000g/mol以60%-75%(w/w)添加量加入到浓度为1000-10000mg/kg的蔗糖溶液中,发现表观黏度和动态模量随着葡聚糖浓度增加而增加,且与其分子量呈现强相关性；采用差示扫描量热仪法测量样品玻璃化转变温度(Tg),用Fox模型和扩展的Gordon-Taylor模型对Tg与葡聚糖分子量和浓度之间的相关性进行分析,发现葡聚糖分子量和浓度越大,玻璃化转变温度升高越大,证实了扩展的Gordon-Taylor模型可以有效预测不同葡聚糖-蔗糖混合溶液的玻璃化转变温度。采用1H,13C及二维核磁共振技术(COSY和HMQC)、GC-MS、MALDI-TOF等解析了葡聚糖(SC-Dex)的结构。采用酒精沉淀和凝胶过滤层析的方法,从变质甘蔗中提取葡聚糖。利用总酸水解和酶解的方法确定定分离到葡聚糖的纯度。结果表明,SC-Dex萄聚糖主链是由D-葡萄糖通过α-(1-6)糖苷键连接而成,分支主要为D-葡萄糖通过α-(1-3)糖苷键连接；甲基化分析表明,α-(1-3)分支度为4.37%；MALDI-TOF分析显示分子离子峰的质量差异为162g/mol,表明SC-Dex的重复单元为D-葡萄糖；SC-Dex的表面形态为球形并具有多孔结构；HPSEC-MALLS-RI分析表明,SC-Dex的重均分子量为1.753x106g/mol,多分散指数为1.069。研究了糖加工不同阶段葡聚糖酶的添加对剩余葡聚糖分子量参数和固有黏度的影响。采用分光光度法测定葡聚糖酶的相对活性,并用高效液相色谱测定还原糖含量的方法对其进行验证。为进行对比,分别对葡聚糖酶进行了浓缩和稀释。发现在蔗糖汁中添加葡聚糖酶比在蒸发糖浆中添加能更有效降低剩余葡聚糖分子量,且更有经济价值；在优化条件糖汁pH5.5时添加葡聚糖酶可得到最低特性黏度和最小分子量,、与优化温度为55.0℃时的结果相似,但当糖度超过20°Brix时,酶活性降低；葡聚糖去除率随着葡聚糖酶添加量增加而增大,当葡聚糖酶浓度达到100ppm时,葡聚糖去除率最高,为80.29%；此外,在加工过程中,反应时间越长,剩余葡聚糖分子量越低；为达到满意的水解度,葡聚糖酶的用量需根据因高糖度造成酶活损失来矫正。在优化了萄聚糖酶使用后,研究了不同温度下葡聚糖酶催化萄聚糖水解物对糖生产中蔗糖结晶速率和纯蔗糖溶液中晶体生长速率的影响。为说明萄聚糖水解对蔗糖晶体生长速率的影响,将2,000,000g/mol(T2000)分子量的葡聚糖以1000-10000mg/kg添加量加入到55%-70%(w/w)的蔗糖溶液中,并分别加入3种浓度50、75、100ppm的萄聚糖酶。在加入T2000的糖液酶解后,发现蔗糖结晶速度提高了,并发现结晶表面比报道的仅添加T2000葡聚糖的更好。结果表明,在添加100ppm萄聚糖酶水解T2000葡聚糖后,相比于纯蔗糖液中添加T2000葡聚糖,结晶速率提高了高达73.56%。因此,采用添加萄聚糖酶水解萄聚糖可以提高蔗糖结晶速率,从而降低糖制造成本。研究了提高葡聚糖酶活性的新方法,超声辐射(US)处理对葡聚糖酶催化活性和酶水解动力学参数的影响。发现US能够提高葡聚糖酶的催化动力学活性；在超声频率25kHz、超声功率40W、超声时间15min时,葡聚糖酶活性达最高,比常规50℃加热处理提高了13.43%；动力学研究表明,超声处理后Vmax和KM值均增加,表明超声处理能够促进底物转化。另外,我们还研究使用其它方法结合超声处理来提高酶的活性。研究了US与高静水压(US/HHP)联合处理对葡聚糖酶催化活性和酶反应动力学参数的影响,采用荧光光谱和圆二色谱对处理后葡聚糖酶的结构进行了分析。结果表明,当US功率40W、频率25kHz、处理时间15min,HHP压力400MPa、处理时间25min时,葡聚糖水解度达到最大,比常规50℃加热处理增加了163.79%；Vmax、Km、Kcat均比US、HHP单独处理及常规方法有所提高；与US、HHP和常规方法相比,US/HHP组合处理降低了酶反应的Ea、△G和ΔH,但ΔS略微升高；荧光光谱法和圆二色谱解析表明,US/HHP处理增加了葡聚糖酶表面的色氨酸数量,α折叠增加了19.8%,无规卷曲减少6.94%,这有利于提高酶活。研究了超声波和微波辐射(US/MIS)对葡聚糖酶水解葡聚糖的协同作用。采用US(50W,40kHz)和不同功率的微波辐射(10-140W、2450MHz、20sec/min)对葡聚糖酶进行处理,结果显示,US/MI-S处理后葡聚糖水解度比单独采用US、MI-S以及常规方法明显增大,在US功率50W、MI-S功率60W、频率20sec/min、时间25min时,水解度达到最大,比常规加热方法提高了163.58%；与单独处理相比,组合处理后酶的Vmax和KM增加,Kcat和(Kcak/Km)比常规方法提高；组合处理后酶的Ea、ΔG和ΔH均降低,ΔS略微升高；圆二色谱法显示组合处理和US处理降低了酶分子β折叠和无规卷曲含量,MI-S处理提高了β折叠和无规卷曲含量；然而,荧光光谱显示酶二级结构的降解速率比三级结构降解速率慢,可见US/MI-S处理导致了葡聚糖酶二级结构的重排,有助于提高其活性。综上所述,在糖的工业生产过程中,将US与HHP或MI-S进行联用,可以作为一种新的手段来提高葡聚糖酶的工业应用效率,本研究将为相关领域的研究提供依据。
【作者】MohanadOsmanAdamBashari；
【导师】JinZhengyu；
【作者基本信息】江南大学，FoodScience&Technology，2014，博士
【关键词】葡聚糖酶；葡聚糖；超声辐射；高静水压；微波辐射；酶活；酶动力学；

【参考文献】
[1]钱金山.微型计算机通信技术[J].电讯技术.1992(03)
[2]牟孝金.职业技术教育学专业研究生培养模式研究[D].西安建筑科技大学,职业技术教育学,2013,硕士.
[3]酒书梅.场独立场、依存认知风格与高中生的英语学习效能相关性研究[D].河北师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[4]黄思园.亚轨道飞行器机翼外形多学科设计优化技术研究[D].国防科学技术大学,航空宇航科学与技术,2012,硕士.
[5]马金胜.大型客车车内噪声及其控制[D].大连理工大学,动力工程,2003,硕士.
[6]金丹.超声斑点追踪技术评价左向右分流先天性心脏病心脏扭转功能的临床研究[D].华中科技大学,影像医学与核医学,2013,硕士.
[7]石碧.基于RTL级实现的ADPCM编解码器[D].合肥工业大学,微电子学与固体电子学,2004,硕士.
[8]王光宗.抗疲劳光导纤维[J].光通信研究.1990(04)
[9]沈萍.江苏省第三产业可持续发展水平的评估[D].南京师范大学,环境地理学,2012,硕士.
[10]郭媛.从罗斯的以色列小说解读其犹太性[D].江苏师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[11]彭婧婕.《论语》英译的主体间性研究[D].浙江工商大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[12]扈畅.“Graphene”研究及翻译[J].化学世界,2015,05:307-310+314.
[13]邹佳辰.亚历山大·汉密尔顿与美国金融体系的建立（1789-1795）[D].吉林大学,世界史,2013,硕士.
[14]余霞.湘江长沙段土壤和沉积物地球化学特征及重金属污染分析[D].湖南师范大学,自然地理学,2013,硕士.
[15]翟英汉.大尺寸KDP晶体高效生长装置主机研制[D].大连理工大学,机械工程（专业学位）,2013,硕士.
[16]朱昆.技术壁垒对我国农产品出口的影响研究[D].安徽大学,国际贸易学,2013,硕士.
[17]时少坤.环境因子对贝类几种免疫因子影响的研究[D].上海海洋大学,临床兽医学,2013,硕士.
[18]杨捷.大学生情绪智力、心理韧性与应对方式的关系研究[D].河北大学,发展与教育心理学,2014,硕士.
[19]曾过房.元宝山发电厂人力资源激励机制的探讨[D].大连理工大学,工商管理,2003,硕士.
[20]葛毅鹏.洛阳丽景门历史街区的恢复与复兴研究[D].湖南大学,建筑设计及其理论,2011,硕士.
[21]丁洋.低透气性煤层深孔预裂爆破增透抽采瓦斯技术研究[D].西安科技大学,安全技术及工程,2013,硕士.
[22]李珊珊.对24Q公司人才流失问题及其对策的研究[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[23]张龙飞.高精度航空物探调查计划项目整合集成[D].中国地质大学（北京）,计算机科学与技术,2013,硕士.
[24]谷文干.明季辽东战事小说研究[D].扬州大学,中国古代文学,2012,硕士.
[25]徐骁.改制后大学出版社发展对策研究[D].首都经济贸易大学,企业管理,2014,硕士.
[26]许德涛.大学生创新创业教育研究[D].山东大学,学生事务管理与学生发展指导,2013,硕士.
[27]秦中广.基于粗糙集的交叉研究及其在中医诊断的应用[D].华南理工大学,2002.
[28]赵志强.基于CAN/3G技术的车载终端监控系统的设计与实现[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[29]周丽.山东省“省直管县”财政体制研究[D].山东财经大学,财政学,2012,硕士.
[30]王亚楠.胡江涛依法行政思想研究[D].太原科技大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[31]王彦斌.城市轨道交通CBTC系统无线干扰技术的研究[D].北京交通大学,2014.
[32]王小宜,卢正鼎,凌贺飞.一个基于小波的时序数据异常探测新算法[J].计算机工程与科学,2005,06:83-85.
[33]王登瀛.多目标决策方案优选的相似优序值法[J].系统工程.1992(01)
[34]王志军.基于生产要素分析的甘肃省产业结构优化研究[D].兰州商学院,财政学,2013,硕士.
[35]李晨.“人民之子”与“荒芜英雄”—张承志论[D].上海大学,中国现当代文学,2014,博士.
[36]赵利.基于RFID中间件的海量数据集成技术及其在现代物流决策分析中应用研究[D].扬州大学,计算机应用技术,2012,硕士.
[37]张玺.学生伤害事故中学校民事责任研究[D].贵州民族大学,民商法学,2012,硕士.
[38]孙法柏,高慧璇.环境法律政策内部整合理论探讨[J].时代法学,2014,04:34-42.
[39]李晓文.基于知识管理和系统模型的学习型组织设计研究[D].广东工业大学,企业管理,2004,硕士.
[40]李强,陈凯华,赵云生,管崇学.W-FGD中折板式除雾器性能的数值模拟[J].煤炭转化.2007(03)
[41]李凤晓.牛磺酸对Aβ_(1-40)毒性的保护作用研究[D].青岛大学,药理学,2013,硕士.
[42]荆政军.激光熔覆WC对蠕铁热疲劳后耐磨性的影响[D].吉林大学,材料加工工程,2013,硕士.
[43]王申申.吉林省普通高校硕士研究生公共体育课教学现状调查及对策研究[D].长春师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[44]张楠,田盛丰,贺志.联机分析关联规则挖掘的研究[J].微机发展,2003,10:8-11+14.
[45]钱国玲.2003年～2012年版权纠纷诉讼的统计分析[J].现代出版,2014,01:28-30.
[46]郭金波.自噬抑制剂氯喹对体外活化肝星状细胞胶原代谢的影响[D].河北医科大学,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[47]李胜管.虚拟股法律问题研究[D].湖南师范大学,民商法学,2014,硕士.
[48]王跃东.水果输送过程中定向机理的研究[D].新疆大学,工程力学,2013,硕士.
[49]赵文峰.微波法制备秸秆活性炭及其对甲苯吸附性能的研究[D].西安建筑科技大学,环境工程,2013,硕士.
[50]曾腾缠,王公仆,盛琦贤,李仕毅.基于红外感知与无线应答的非接触式门禁系统设计[J].微型机与应用,2014,19:34-37.