节杆菌黄嘌呤氧化酶生物合成调控与酶稳定性研究

【摘要】黄嘌呤氧化酶（Xanthineoxidase，EC1.17.3.2，XOD）属于黄素蛋白氧化酶类中较为复杂的多亚基蛋白，其底物催化机理复杂，除需辅因子FAD，还需钼蝶呤及铁硫簇辅因子。这三种辅因子以严格的比例及特定的顺序排布于XOD结构内部，联合最终电子受体（分子氧），共同催化嘌呤类物质的降解。相比于黄嘌呤脱氢酶（Xanthinedehydrogenase，EC1.17.1.4，XDH），XOD在医学诊断、食品检测、工业催化及环境保护中的应用价值更为广泛。本论文以一株拥有自主知识产权的XOD产生株—节杆菌（Arthrobacter）M3为研究对象，探讨发酵合成XOD的调控技术；合成筛选含特异性配体的亲和介质，创建简易亲和纯化XOD的方法，并分析酶热不稳定机理；探寻可有效提高XOD稳定性的技术；研究次黄嘌呤/黄嘌呤降解代谢产物与XOD合成的关系，利用等离子体诱变，半定向筛选代谢产物抑制得到衰减的突变株。主要研究结果如下：考察次黄嘌呤（诱导物）及辅因子添加对XOD合成的影响，发现，次黄嘌呤最佳诱导浓度为3.6gL-1，而添加辅因子前体核黄素（0.30mgL-1）及硫胺素（6.0mgL-1）可分别使XOD平均产率提高17.0%和16.3%。根据不同pH值控制下ArthrobacterM3的发酵过程曲线和动力学参数变化，提出了分段式pH调控技术，即在发酵前期以初始pH8.6进行自然发酵，待菌体密度至2.0gL-1时，控制发酵液pH值为7.6。该分段式pH调控技术的应用，使XOD平均产率（1229.7Ug-1）比单独使用恒pH7.6发酵和自然pH发酵（初始pH8.6）时分别提高了86.3%和89.4%；酶活水平（7415.3UL-1）分别提高了75.0%和91.0%。以Logistic方程和Luedeking-Piret方程描述了分段式pH发酵过程中菌体生长、XOD积累以及基质（残糖）消耗的模型，模型相关系数（R2）均大于0.97。分别以鸟嘌呤（黄嘌呤结构类似物）及核黄素（FAD前体）为配体，合成了亲和介质（琼脂糖为载体）。吸附分析表明，琼脂糖-鸟嘌呤亲和介质对XOD的吸附能力较佳（2.0mgg-1介质），并利用液质联用技术证实了鸟嘌呤配体与琼脂糖载体的成功偶联。采用硫酸铵盐析、琼脂糖-鸟嘌呤亲和层析及DEAE-SepharoseCL-4B离子交换层析共3步法，简易地纯化了ArthrobacterM3XOD，比酶活为1033.2Umg-1，纯化倍数为120.1，回收率为36.1%。研究ArthrobacterM3XOD的酶学性质则表明：XOD为含有两个亚基（100kDa和35kDa）的异质二聚体蛋白，相对分子质量135kDa，与Arthrobactersp.FB24XDH的匹配度较高（肽质量指纹图谱分析）；最适反应温度为37℃，最适反应pH为7.5，且对不同金属离子（2.0mmolL-1）的耐受性具有差异，对黄嘌呤的动力学常数Km为0.67mmolL-1。对50℃保温不同时间的XOD酶液进行分析，发现XOD热不稳定机理主要为疏水基团暴露引起的蛋白集聚。以XOD的热不稳定机理为指导，针对性的添加了海藻糖和甜菜碱等保护剂。结果表明，添加1.0molL-1海藻糖可使XOD半衰期（50℃）延长至6.9h（对照组仅为0.84h），凝胶过滤色谱分析表明海藻糖的加入有效抑制了蛋白集聚。分别选用阴离子交换树脂（201×4、D201及D354）离子吸附固定化、聚丙烯酰胺及海藻酸钠物理包埋固定化、疏水性载体（D840）及亲水性载体（含不同间隔臂长度的琼脂糖）共价偶联固定化处理XOD，不同程度提高了酶热稳定性。其中，以海藻酸钠物理包埋的固定化酶酶活回收率较高（17.3%）；50℃保温2h，以琼脂糖-乙二胺载体共价偶联的固定化酶相对酶活保留率较高（90.9%）。将琼脂糖-乙二胺载体固定化的酶与游离酶比较，固定化酶于不同pH和温度下的耐受性均提高，半衰期延长至5.5h（50℃），重复使用8次后，相对酶活仍保留41.2%。研究次黄嘌呤/黄嘌呤降解代谢途径中关键代谢产物（自由基、尿酸、尿素及铵根离子）与XOD合成的关系，发现，在XOD发酵合成过程中，嘌呤代谢含氮终产物—铵根离子是抑制XOD合成的关键因子；积累的代谢中间产物尿素对XOD合成基本无影响，且积累浓度（1.10gL-1）远低于其抑制XOD合成的浓度（≥15.0gL-1）。为减弱次黄嘌呤/黄嘌呤降解代谢途径中尿素向铵根离子的降解，采用等离子体诱变，经三级筛选平板初筛，半定向选育了一株低产尿素降解酶的突变株ArthrobacterM605，与出发菌株ArthrobacterM3相比，其尿素降解酶平均产率降低了49.3%。补料分批发酵条件下，突变株ArthrobacterM605的XOD平均产率及酶活水平提高至1168.5Ug-1和12970.6UL-1，分别比出发菌株ArthrobacterM3提高了38.6%和42.5%。
【作者】张玉然；
【导师】王武；
【作者基本信息】江南大学，发酵工程，2014，博士
【关键词】黄嘌呤氧化酶；节杆菌属；合成调控；亲和纯化；稳定性；嘌呤降解代谢；等离子体诱变；

【参考文献】
[1]翟璐.我国银行理财产品同质化与差异化问题的研究[D].吉林大学,金融学,2014,硕士.
[2]尹依明.马克思主义哲学的公共性维度及其当代价值[D].安徽大学,马克思主义哲学,2014,硕士.
[3]汪书锋.快速乡村城镇化背景下的古村保护规划研究[D].广东工业大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[4]张战锋.分布式变频泵热水供热系统换热站运行控制研究[D].长安大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2013,硕士.
[5]孙焕良.基于空间划分的优化聚类算法及相关技术研究[D].东北大学,2005.
[6]杨俊杰,周涛,章雪峰.FRP管实心混凝土柱承载力的轴压试验研究[J].建筑结构,2014,22:72-75+89.
[7]孙冬晓.基于液质联用技术的金钱草与广金钱草化学成分比较及广金钱草的药动学和排泄动力学研究[D].河北医科大学,药物分析学,2013,硕士.
[8]郝秀兰.多光谱遥感图像压缩技术研究[D].西北工业大学,信号与信息处理,2004,硕士.
[9]周俊岑.镁合金在医疗领域的应用研究[D].西南大学,应用化学,2014,硕士.
[10]年佳乐.土默川平原盐渍土性状与微量元素空间分布特征研究[D].内蒙古农业大学,土壤学,2013,硕士.
[11]马舒亭.高中鉴赏学习中元认知能力培养研究[D].首都师范大学,美术学,2013,硕士.
[12]杨露萍.小汽车通勤出行方式向公共交通转移模型研究[D].北京交通大学,2014.
[13]舒远良.数字校园环境下的研究生管理信息系统设计[D].吉林大学,软件工程,2013,硕士.
[14]壮志,安利.移动计费哪个更准——电信行业系列报道之二[J].中国计算机用户,2001,Z1:63-67.
[15]张晓凯.贫困大学生教育救助问题探析[D].天津财经大学,社会保障学,2012,硕士.
[16]王信喜.饲粮赖氨酸水平对仔鹅生长性能、屠宰性能和血液生化指标的影响[D].扬州大学,特种经济动物饲养,2012,硕士.
[17]王鹏.肖斯塔科维奇《第二钢琴协奏曲》音响版本比对研究[D].中国音乐学院,音乐学,2012,硕士.
[18]王自严.数据挖掘技术在环境信息管理中的应用[D].河北工业大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[19]孟艾芜.我国中小企业引入现金流指标体系重要性的分析[D].山西财经大学,会计学,2013,硕士.
[20]邓龙,沈际海,许娜,吕立华.基于炉内辐射模型的加热过程分析[J].冶金自动化.
[21]彭枫.高压下新型化学反应的示范研究[D].吉林大学,2014.
[22]靳振国.论社会保险权及其国家义务[D].吉林大学,法律,2012,硕士.
[23]周翔.电视新闻语言研究[D].信阳师范学院,汉语言文字学,2014,硕士.
[24]黄建新.关于我国服装品牌营销问题的浅析[J].现代营销(学苑版),2015,02:35-36.
[25]闫以秀.Al-Si/Al_2O_3-SiC核壳结构颗粒的制备与性能表征[D].哈尔滨工业大学,材料学,2013,硕士.
[26]杨德鹏.中国公用会议电视网构架及系统组成[J].世界电信.1995(06)
[27]李丹.帮助学习者个体建立听力理解中的元认知模式[D].西北工业大学,外国语言学及应用语言学,2004,硕士.
[28]王培风.基于儒家文化的国企领导者行为与员工满意度相关性研究[D].燕山大学,企业管理,2014,硕士.
[29]杨光.网络诽谤的刑法规制[D].黑龙江大学,法律,2013,硕士.
[30]姚超善.以李昌奎案为例审思司法判决中的“法律修辞”[D].山东大学,法学理论,2013,硕士.
[31]颜小虎.中文搜索引擎的发展现状与趋势研究[D].北京印刷学院,2005.
[32]马哲.应用Coh-Metrix3.0对雅思学术型阅读文本进行内容效度的定量性探究[D].首都师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[33]许仲仁.热成像系统对海上超低空目标跟踪距离计算方法研究[J].舰船科学技术.2001(04)
[34]花庆祥.电子商务环境下电子信用证的相关法律问题研究[D].内蒙古大学,法律,2014,硕士.
[35]卢静.操纵理论视角下字幕组的翻译[D].四川外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[36]马强.政治文化视角下的当代俄罗斯对华政策研究[D].黑龙江大学,俄语语言文学,2013,硕士.
[37]陈丽阳.人物梦魇 叙事传奇[D].东北师范大学,中国现当代文学,2012,硕士.
[38]穆静,蔡远利.一种迭代离差差分滤波算法及其应用研究[J].控制与决策,2011,09:1425-1428.
[39]苏泽文.NBSA在咯血介入治疗中的意义及与胸膜增厚的关系[D].山西医科大学,影像医学与核医学,2013,硕士.
[40]梁小珍.新媒体文学的审美特性[D].辽宁大学,文艺学,2012,硕士.
[41]陈蓉.《老乞大》《朴通事》紧缩句研究[D].西南大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[42]姜英华,李安平.构建集中管理式电子邮件系统[J].电脑学习.2006(03)
[43]戴莹莹.国外对华反补贴法律问题研究[D].贵州民族大学,法律,2014,硕士.
[44]么健石,侯祥林,徐心和.二级倒立摆摆起控制的研究[J].控制与决策,2004,10:1183-1186.
[45]赵蕾.DY银行个人信贷业务流程再造[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[46]孟庆昇.中国历史上贵义贱利思想的研究[D].东北财经大学,经济思想史,2003,硕士.
[47]王富明.初发性及复发性肩关节前脱位治疗的系统评价[D].南方医科大学,骨外科学,2012,硕士.
[48]王婧玮.浑水公司做空中国概念股的财务分析方法研究[D].首都经济贸易大学,会计（专业学位）,2013,硕士.
[49]刘承军.首钢矿业公司质检中心成功研制白灰螺旋自动取样器[J].冶金自动化,2009,06:27.
[50]付志敏.佛山市供水安全性评估及应急体系构建研究[D].哈尔滨工业大学,市政工程,2013,硕士.