宇佐美曲霉木聚糖酶AusXyn10A的克隆表达及耐热性的改造研究

【摘要】随着人们对自然界中生物质资源和农业副产品开发利用的重视和低聚木糖生理功能研究的深入，作为生物质资源降解酶系主要成员的木聚糖酶也成为近几年研究的热点。β-1,4-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)能够作用于木聚糖主链内部，通过随机切割的方式将木聚糖降解为低聚木糖和少量木糖。作为一种绿色高效的生物催化剂，木聚糖酶已被广泛应用在饲料、造纸、医药、能源及食品等工业领域中。虽然目前国内外已有大量木聚糖酶已被克隆和表达，但多数酶常常难以满足工业应用中经常遇到或需要的高温环境，因而限制了该酶的应用范围。论文克隆了宇佐美曲霉(Aspergillususamii)E001GH10家族木聚糖酶AusXyn10A的完整cDNA和DNA序列，将该酶成熟肽的编码基因实现了在毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115和大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21中的异源表达，并在此基础上利用计算机辅助设计通过N/C端片段替换、二硫键添加以及点突变对该酶的热稳定性进行了理性/半理性改造研究，主要研究结果如下：(1)构建了一种发卡结构介导的PCR(HSO-PCR)技术，结合3′-RACE和5′-RACE方法获得了AusXyn10A基因完整的cDNA和DNA序列；cDNA序列长度为1,235bp，包括80bp的5′-端非翻译区、984bp的开放读码框和171bp的3′-端非翻译区，可编码327个氨基酸；其DNA长度为2,255bp，包含9个长度为52-62bp的内含子；生物信息学分析的结果表明AusXyn10A包括19个氨基酸残基的信号肽、6个氨基酸残基的前导肽和302个氨基酸残基的成熟肽。(2)构建了一种蛋白天然N端表达质粒pPIC9KM，并应用该质粒将AusXyn10A成熟肽的编码基因整合到P.pastorisGS115基因组中，获得的高拷贝重组子GSX10A4-14产酶活性高达100.8UmL-1；经优化后GSX10A4-14在接种量8%、初始pH值7.0、甲醇诱导量2.5%、温度30℃及诱导时间120h的表达条件下产酶水平可达368.6UmL-1，是优化前酶活性的3.25倍；结果表明，reAusXyn10A的最适反应pH和温度分别为5.5和50℃、在45℃以下及pH值4.5~8.5之间具有较好的稳定性；除Mn2+离子外，其它所测的金属离子及EDTA对该酶的酶活性没有明显的影响；以桦木木聚糖为底物，reAusXyn10A的Km和Kcat值分别为2.25mgmL-1和3,419.4s-1；以玉米芯木聚糖为底物，优化后的水解条件为：底物浓度50gL-1，酶添加量300Ug-1，反应时间10.0h后体系中的还原糖量可达15.45gL-1，TLC分析显示其水解产物以木三糖为主，表明该酶具有制备低聚木糖的应用潜力。(3)根据海栖热袍菌(Thermotogamaritima)MSB8中的嗜热木聚糖酶TmxB和AusXyn10A的序列比对结果，将AusXyn10AC端的A300NA302替换为TmxB中的KEVLEKKIEER，利用大引物PCR技术构建出AusxynCRC1并在P.pastoris中表达；结果表明，reAusXynCRC1的最适温度为50℃，与原酶reAusXyn10A一致，但该酶在50℃下的半衰期仅为5min，较原酶的40min有明显的降低；根据三维结构比对结果，在AusXynCRC1的基础上引入突变H13L和A12K，构建AusXynCRC2并在P.pastoris中表达；结果表明，突变酶reAusXynCRC2在50℃的半衰期由reAusXynCRC1的5min提高到8min，在50℃下保温10min后残余相对酶活由0%提高到40%；此外，reAusXynCRC2的比酶活较原酶提高38%。(4)根据分子动力学模拟和B因子(B-factor)值计算，确定用嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)中嗜热木聚糖酶TaXyn10N端区域的氨基酸片段YTLTKDSKTP替换AusXyn10A相对应的片段N24RLTTGKNA32，构建N端片段替换酶AusXynCRN1基因并在P.pastoris中表达；结果表明reAusXynCRN1的最适温度与原酶reAusXyn10A一致，在55℃下半衰期由6.9min提高到了8.0min；根据三维结构比对分析结果，在AusXynCRN1中同时引入突变S286G和H288F，构建突变酶AusXynCRN2并在P.pastoris中表达；结果表明，reAusXynCRN2的最适温度为60℃，较原酶提高了10℃，在55℃的半衰期由6.9min提高到了72min，是原酶的10.4倍，此外reAusXynCRN2的比酶活为8,129Umg-1，较原酶reAusXyn10A提高49%，该结果也表明基于分子动力学模拟的热稳定性预测具有一定的可行性。(5)根据DisulfidebyDesignV1.20软件和分子动力学模拟预测结果，筛选出RMSD值低于原酶AusXyn10A的二硫键突变酶D7C/G42C和S246C/A297C并分别在P.pastoris中表达；结果表明，reS246C/A297C的最适温度为55℃，较原酶提高了5℃，且在50℃保温60min残余酶活大于80%，较原酶（残余酶活39%）有明显提高，表明246-297位二硫键的添加能够大幅提高酶的热稳定性；reD7C/G42C的最适温度和热稳定性较原酶则有一定程度的下降。(6)通过表达质粒pET-28a实现AusXyn10A在E.coliBL21中的表达，并使用PCR仪和酶标仪对其酶学性质进行分析，结果表明，经E.coliBL21表达的AusXyn10A的最适反应温度为44℃，最适pH值为5.5，在pH6.6~7.8的范围内稳定，为后续的高通量筛选打下基础；根据B-factor值计算结合多序列比对分析，选择R59、S278和S280三个位点实施饱和突变或定点突变；经转化、高通量筛选及热稳定性分析，获得S280V、S278A、N111S和R59C/A35G四株热稳定性提高突变子；它们的最适温度较原酶AusXyn10A(44℃)均提高了约2.0℃，T5020值较AusXyn10A分别提高了2.0℃、2.0℃、0.8℃和0.7℃；根据论文中所有突变子的分析结果，将N端片段替换(含突变S286G/H288F)及D7C/G42C二硫键突变进行组合，获得的突变酶reXynCRN2-S246C/A297C的t1/260值为19min，是reAusXynCRN2t1/260值的1.6倍，表明该突变酶热稳定性较reAusXynCRN2有了进一步的提升。
【作者】汪俊卿；
【导师】邬敏辰；
【作者基本信息】江南大学，发酵工程，2014，博士
【关键词】木聚糖酶；热稳定性；理性/半理性设计；片段替换；定点突变；

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