牛狂犬病的病毒全基因组序列分析及病理学研究

【摘要】狂犬病是由狂犬病病毒引起的侵害中枢神经系统的一种人畜共患传染病,致死率几乎为100%。2010年底至2013年初,在内蒙古自治区一些奶牛饲养场和放牧区出现了奶牛狂犬病样病例,本文结合本次牛病,对该地区牛狂犬病病毒的分子生物学特征和致病性做了较深入研究,以为狂犬病的防治提供依据。本研究对24个奶牛饲养场(户)和1个放牧区17个病例(12例病牛和5例病犬)进行发病情况、流行病学调查和临床症状观察,以及对病死牛的病理学检查、免疫荧光染色和病毒核酸检测。选取3例典型病例的脑组织通过乳鼠脑内接种,分离病毒。根据GenBank狂犬病病毒的基因序列,设计了PCR的16对引物和末端测序的3条引物,采取RACE和RT-PCR方法,对全基因组序列分段扩增,拼接出病毒的全基因组序列,并对其进行序列比对和遗传演化分析。应用分离的毒株分别经肌肉和脑内接种不同年龄段(1日、4日、10日、2周、3周和4周)的小鼠,研究不同病毒毒株的毒力及其在脑内的分布和定位特征。用分离的毒株脑内接种10日龄乳鼠,在发病濒死期扑杀乳鼠,取脑组织,应用病理组织学染色、透射电镜、免疫荧光、原位杂交等方法,研究脑组织的病理组织学变化、超微结构病变、细胞凋亡、炎性细胞特征、神经细胞突起(MAP-2)的病变,以及病毒抗原与神经细胞突起病变、IL-1βmRNA、RANTESmRNA和TIMP-1mRNA表达阳性细胞的相关性。结果表明：(1)17例病例RABV核酸阳性率为100%；牛狂犬病病理组织学病变群主要为神经细胞内形成胞浆内嗜酸性包涵体、非化脓性脑炎、肉芽肿样病变和变质性变化。(2)通过乳鼠脑内接种,分离到3株狂犬病病毒,分别命名为CNM1101C、CNM1103C和CNM1104D,其基因组全长分别为11924nt、11917nt和11924nt,GenBank登陆号分别为KC193267、KC252633和KC252634。3株病毒均具有狂犬病病毒基因组的典型结构特征,基因组(G+C)%含量平均为44.56%,均属于基因Ⅰ型。(3)本研究分离的3株病毒与GenBank已公布的60株狂犬病毒各编码蛋白和基因同源性分析表明,N、P、M、G和L基因与编码蛋白的同源性依次为88.7%～100%(97.2%～100%)、85.4%～100%(91.3%-100%)、88.3%～100%(93.4%～100%)、85.8%～100%(91.6%～100%)和87.3%～99.9%(95.2%～100%),5个蛋白的保守性依次为P<G<M<L<N。(4)本研究分离的3株病毒各结构蛋白的主要功能位点保守,但部分位点亦有氨基酸的突变发生,这种突变对病毒的毒力和免疫原性可能会产生影响。此外,CNM1103C株病毒与蒙古狼源和俄罗斯红狐分离株拥有较近的亲缘关系,CNM1101C和CNM1104D株病毒与大陆流行株亲缘关系较近。(5)3株病毒两种感染途径致小鼠发病年龄及病死率结果显示,3株病毒株的毒力强弱次序依次为CNM11O1C>CNM11O3C>CTN。3株病毒株在濒死小鼠脑内绝大多数部位均有病毒的感染,其中以小脑和脑干的病毒量较多,但不同的病毒株在脑内的分布略有不同。(6)CNM1101C、CNM1103C和CTN3株狂犬病病毒感染乳鼠后,脑组织的病理学变化有一定程度不同。感染3株病毒乳鼠脑组织中,病毒抗原阳性细胞包括神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。(7)狂犬病毒强毒和弱毒的感染均可引起乳鼠脑组织细胞TIMP-1mRNA、RANTESmRNA和IL-1βmRNA表达上调,但弱毒在脑内引起的TIMP-1mRNA和IL-1βmRNA2种炎症因子的表达高于强毒,弱毒在脑内引起的RANTESmRNA炎症因子的表达不及强毒；即使是强毒,在脑内引起3种炎症因子的表达与其集中发生的部位也因毒株的不同而有差异。研究表明：本研究所检的11例奶牛、1例黄牛和5例犬病例均为狂犬病。分离到的3株病毒均具有狂犬病病毒基因组的典型结构特征,均属于基因Ⅰ型；各结构蛋白的主要功能位点保守,但部分位点亦有氨基酸的突变发生；CNM1103C株病毒与蒙古狼源和俄罗斯红狐分离株亲缘关系较近,CNM1101C和CNM1104D株病毒与大陆流行株亲缘关系较近。不同毒力狂犬病毒株感染乳鼠后引起脑组织不同程度的病理变化。感染3株病毒乳鼠脑组织RABV抗原阳性细胞有神经细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞。
【作者】尹景峰；
【导师】王凤龙；唐青；
【作者基本信息】内蒙古农业大学，基础兽医学，2014，博士
【关键词】狂犬病；奶牛；病理学；全基因组；致病性；

【参考文献】
[1]张旭瑞.水相CdTe量子点的稳定性及其复合纳米粒子的研究[D].复旦大学,高分子化学与物理,2012,硕士.
[2]邱明.万路运业营销战略研究[D].西南财经大学,工商管理,2003,硕士.
[3]安立华.基于PIC16F876的暖风机控制系统的设计与实现[D].东北大学,电路与系统,2010,硕士.
[4]续晓花.我国私募股权基金的法律问题研究[D].云南财经大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[5]周建军.互联网对城市中学德育的影响及其对策分析[D].广西师范大学,教育,2003,硕士.
[6]徐舒蔓.化痰祛痰、软坚散结法治疗高脂血症的临床观察[D].北京中医药大学,中医学,2014,硕士.
[7]刘宝平.壳聚糖防治水稻白叶枯和细条病的机制及壳聚糖—纳米复合抗菌材料研究[D].浙江大学,植物病理学,2012,硕士.
[8]谢书红.我国实施延续护理的系统评价[D].吉林大学,护理学,2013,硕士.
[9]赵立伟,刘忠,李海燕.浅析滚切式双边剪[J].一重技术.2006(06)
[10]王爽.大学英语教师中介作用研究与分析[D].辽宁师范大学,英语语言文学,2012,硕士.
[11]陈璐.美国重返东南亚背景下的南海争端[D].中共中央党校,国际政治,2013,硕士.
[12]何正和.手性1-Azaspiro[4.4]nonane骨架配体的设计、合成及其催化不对称氢转移反应研究[D].兰州大学,有机化学,2014,硕士.
[13]王淑娟.基于嵌入式Web服务器的远程监控系统的研究[D].武汉理工大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[14]李勇.泸天化1620t/d尿素装置蒸发系统扩能改造的方案研究[D].四川大学,化学工程,2003,硕士.
[15]秦扬远.电子商务环境下供应链管理研究[D].福州大学,2004.
[16]李宇.赣抚平原灌区渠道生态护坡技术研究[D].南昌大学,水利工程,2014,硕士.
[17]吴立胜.生长抑素类似物奥曲肽抑制体外培养人胆管癌细胞生长及其可能机制的实验研究[D].安徽医科大学,外科学,2004,硕士.
[18]李顺辉.含缺陷二维h-BN的第一性原理研究[D].湘潭大学,2013.
[19]江开勇.论提高我国鳗鱼产业国际竞争力策略[D].对外经济贸易大学,国际贸易,2004,硕士.
[20]罗红峰.我国住宅专项维修资金制度研究[D].吉林大学,法律,2014,硕士.
[21]陈文彦.地域性非物质文化传承景观的多维可视化方法[D].河北师范大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[22]李再.变增益预测控制算法研究及在水泥回转窑系统中的应用[D].燕山大学,检测技术与自动化装置,2014,硕士.
[23]张贺新.固体温度继电器自动测控系统的研究[D].合肥工业大学,精密仪器及机械,2004,硕士.
[24]罗小丰.α-氧化铝阻氢机制及核素在石墨上吸附的第一性原理研究[D].清华大学,2014.
[25]郝晓玲.吗啡对大鼠海马神经元肌动蛋白重构的影响及机制研究[D].河北医科大学,药理学,2013,硕士.
[26]邹博威.我国金融服务贸易国际竞争力研究[D].首都经济贸易大学,国际贸易学,2013,硕士.
[27]曾庆和.北京国安足球俱乐部运营管理评价理论体系的研究[D].首都体育学院,体育教育训练学,2013,硕士.
[28]梁朝霞.人免疫重建荷人HPV16阳性宫颈癌SCID鼠模型的建立[D].浙江大学,2004.
[29]张宁.人民币升值背景下中美贸易的反J曲线效应研究[D].吉林大学,金融,2014,硕士.
[30]陈禕峰.榜样示范与价值观对管理者非伦理行为影响的实证研究[D].上海大学,工商管理,2013,硕士.
[31]夏洪艳.从广告主角度探讨电视媒体的广告营销策略[D].厦门大学,2001.
[32]钱大群,孙振飞.神经网络的知识获取与行为解释[J].自动化学报,1994,03:348-351.
[33]姚敏,王方石.基于MVC模式和SSH框架的高校科研管理系统设计与实现[J].电脑知识与技术,2014,11:2485-2487.
[34]丑国珍.城市空间的层次及尺度空间初探[D].重庆大学,建筑设计及其理论,2003,硕士.
[35]岳泓廷.新生代农民工精神文化生活调查研究[D].西南大学,社会学,2014,硕士.
[36]李文兵,毕英杰,纪扬,席政,姜旭,丁茂祥,张锐,李勇.基于生产流程的炼钢-连铸-热轧仿真系统[J].冶金自动化,2005,03:37-42+49.
[37]张应利,何斌.基于物元可拓性的潜信息挖掘[J].数学的实践与认识,2001,05:569-575.
[38]姚利俊.骨传导语音增强算法及其可重构硬件结构研究与实现[D].国防科学技术大学,软件工程,2013,硕士.
[39]郭套连.棉花作物高效增产剂的分子设计、合成与活性分析[D].武汉纺织大学,纺织材料与纺织品设计,2014,硕士.
[40]姜海洋.大连港港口节能减排效率及综合评价研究[D].大连海事大学,物流工程,2012,硕士.
[41]张楠.莱易斯“控制自然”理论及对当代中国生态文明建设的启示[D].兰州理工大学,马克思主义基本原理,2014,硕士.
[42]秦建.兰州威立雅水务集团运营战略研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[43]姚思思.台湾地区防震减灾行政立法研究及大陆地区的防震减灾相关立法借鉴[D].山东大学,宪法学与行政法学,2013,硕士.
[44]管辛.长丝加捻纱形态的数学模型与CAD软件设计[D].苏州大学,纺织材料与纺织品设计,2003,硕士.
[45]白旭光.连续梁桥悬臂浇筑施工关键技术与控制技术研究[D].长安大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[46]李增强.模糊与随机共存的设施选址均衡模型研究[D].青岛大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[47]管天玉.秸秆还田方式对土壤有机碳组分的影响[D].华中农业大学,土壤学,2014,硕士.
[48]吴小艳.普罗科菲耶夫《第三钢琴协奏曲》结构研究[D].西南大学,音乐与舞蹈学,2013,硕士.
[49]张洋.具有靶向分子和pH/还原双重响应性的聚磷酸酯共聚物作为药物和基因的共同载体[D].苏州大学,高分子化学与物理,2014,硕士.
[50]陈菊红.“国家—社会”视野下的流动人口自我管理研究[D].中共中央党校,科学社会主义,2014,博士.