JSRV囊膜蛋白及其亚基诱导NIH 3T3细胞转化与分子发生机制的研究

【摘要】研究背景：绵羊肺腺瘤(ovinepulmonaryadenomatosis,OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiektesheepretrovirus,JSRV)引起的一种慢性、传染性绵羊肺脏肿瘤疾病。JSRV属于p逆转录病毒属,基因组主要包含病毒的结构基因gag、pro、pol和env。其中env是一个癌基因,它的表达产物囊膜蛋白(Env)由表面蛋白(SU)和穿膜蛋白(TM)两个亚基组成,彼此间以二硫键相连。JSRV的受体为透明质酸酶2(Hyaluronoglucosaminidase2,Hyal-2)。由于NIH3T3细胞具有强烈的接触抑制特性,能根据失去接触抑制而明确地识别已发生转化的细胞,故作为一种重要的细胞用于JSRV致瘤机制的研究。近年的研究显示,单独表达JSRVEnv对于诱导NIH3T3细胞转化是必须和充分的,但其具体的转化分子机制中仍存在一些值得探讨的地方。研究目的：进一步探究JSRVEnv及其亚基(SU和TM)诱导NIH3T3细胞转化的分子机制,这对于深入阐明OPA的分子发病机制及确定相应的防控靶点,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。研究方法：1.应用RT-PCR的方法从绵羊瘤胃组织总RNA中扩增Hyal-2的编码序列,构建含有绵羊Hyal-2基因编码区的真核表达质粒。将该真核表达质粒转染NIH3T3细胞,经G418筛选、纯化后,以制备稳定表达绵羊Hyal-2受体的NIH3T3细胞系。2.采用JSRVEnv及其亚基真核表达质粒分别诱导转化NIH3T3细胞和稳定表达绵羊Hyal-2受体的NIH3T3细胞系,并检测比较各转染组与空白对照组间,细胞的接触抑制特性、非锚定依赖性生长能力、增殖活性以及磷酸化Akt含量的差异。3.设计小鼠源kras、nras、egfr、p53和pik3ca肿瘤相关基因常见突变所在外显子的突变点检测引物,采用PCR-SSCP和核酸测序分析法检测JSRVEnv及其亚基诱导转化细胞中肿瘤相关基因的突变情况。4.以内蒙古地区OPA自然病例的肺组织总DNA为模板,克隆JSRV前病毒的gag、pro与pol基因,并应用双酶切的方法将其与已有的LTR、env基因连接起来,以获得含有JSRV前病毒全基因组的重组质粒。研究结果：1.成功构建了含有绵羊Hyal-2基因编码区的真核表达质粒pcDNA-Hyal2-HA,并建立了稳定表达绵羊Hyal-2受体的NIH3T3细胞系。2.在NIH3T3细胞中,Env及TM具有诱导细胞转化、激活Akt的能力；而在稳定表达绵羊Hyal-2受体的NIH3T3细胞系中,仅TM具有这样的能力。3.在JSRVEnv及其亚基诱导NIH3T3细胞转化的过程中,肿瘤相关基因kras、nras、egfr、p53和pik3ca均未发生突变。4.成功构建了包含外源性JSRV前病毒基因组全长的重组质粒pMD-JSRV。核酸序列分析结果表明,本研究重组克隆的pMD-JSRV基因组全长7690bp,具外源性JSRV典型的分子特征,属JSRV-Ⅱ型,与分离自美国的代表株AF105220亲缘关系较近,同源性达95%。结论：1.本研究成功构建了稳定表达绵羊Hyal-2受体NIH3T3细胞系。2.在JSRVEnv诱导NIH3T3细胞转化并激活Akt的过程中,其TM亚基起到了主要作用,并且TM亚基还具有单独诱导NIH3T3细胞转化的能力。3.绵羊Hyal-2具有抑制JSRVEnv诱导NIH3T3细胞转化的作用。4.JSRVEnv及其亚基诱导NIH3T3细胞转化的分子机制与肿瘤相关基因突变可能无关。5.本研究成功构建了包含外源性JSRV前病毒基因组全长的重组质粒pMD-JSRV。这为进一步研究JSRV其他结构蛋白对其Env诱导NIH3T3细胞转化的影响建立了实验平台。
【作者】刘畅；
【导师】马学恩；
【作者基本信息】内蒙古农业大学，基础兽医学，2014，博士
【关键词】绵羊肺腺瘤病毒；囊膜蛋白；NIH3T3细胞；转化；透明质酸酶2；Akt；肿瘤相关基因；

【参考文献】
[1]李鸿儒.长期吸入艾灸烟雾对成都地区医护人员健康情况影响的现况调查[D].成都中医药大学,针灸推拿学,2012,硕士.
[2]徐利刚.OFDM系统中降低峰均比问题的研究[D].浙江工商大学,电子与通信工程（专业学位）,2014,硕士.
[3]包喜超.基于TRIZ理论的攀爬机器人的设计与研究[D].哈尔滨工程大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[4]王旭炜.桑树PAMP途径中相关基因分析和功能研究[D].西南大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[5]傅恒倩.中学英语教科书语篇概念意义的多模态话语分析[D].浙江工商大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[6]王思.上市公司归因信息披露质量及监管研究[D].沈阳工业大学,会计学,2012,硕士.
[7]杨媛媛.河南财政税务高等专科学校科研项目绩效评估研究[D].南京理工大学,项目管理,2013,硕士.
[8]张俊.W研究院技术研发管理研究[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[9]王春萌.血管紧张素Ⅰ转化酶基因多态性与妊高征发生的相关研究[D].江西医学院,妇产科学,2003,硕士.
[10]马洁.加权Bergman空间上的n-Berezin变换与径向算子的强不可约性[D].河北师范大学,应用数学,2013,硕士.
[11]赵成章,高福元,王小鹏,盛亚萍,石福习.黑河上游高寒退化草地狼毒种群小尺度点格局分析[J].植物生态学报,2010,11:1319-1326.
[12]张迪.成都市普通高校乒乓球学生裁判的培养现状与对策研究[D].西南交通大学,体育教育训练学,2012,硕士.
[13]吴晨阳.永定河（北京段）文化地理研究[D].首都师范大学,专门史,2014,硕士.
[14]陶宇.Job-shop类型机器人制造单元调度问题与算法研究[D].广东工业大学,机械工程,2014,硕士.
[15]王丽芳.空心磁性吸波材料的制备及电磁性能研究[D].大连理工大学,材料加工工程,2013,硕士.
[16]张瑜,何俊民,黄润才.小儿出疹性疾病诊断智能超媒体系统中知识约简算法的实现[J].微型电脑应用,2004,05:47-49.
[17]曹超群.基于虚拟样机的装载机工作装置的设计[D].大连理工大学,机械设计及理论,2004,硕士.
[18]赵新.电励磁直驱风力发电机并网控制技术研究[D].北京交通大学,电力电子与电力传动,2014,博士.
[19]康爽.结构参数对光子晶体光纤布拉格光栅慢光的影响[D].兰州理工大学,物理电子学,2013,硕士.
[20]刘锦.充氮储藏对大豆品质的影响[D].南京财经大学,食品科学,2013,硕士.
[21]周健.新疆紫草化学成分研究及根与茎残基成分的比较[D].成都中医药大学,中药学,2012,硕士.
[22]周进.功能化碳纳米材料的制备及其荧光性能研究[D].浙江师范大学,2013.
[23]韩君泽.心电信号自动检测与诊断方法的研究[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[24]朱金华.基于化学问题解决的高中生元认知能力培养[D].曲阜师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[25]吕强龙.冲突与整合—中国数字出版产业链研究[D].复旦大学,新闻学,2013,博士.
[26]胡晓东.基于GIS的南京内秦淮河水系调水模拟集成系统研究和开发[D].河海大学,环境工程,2004,硕士.
[27]牛玉刚,甘峰浩,胡源.基于压缩感知的拥塞控制机制[J].控制与决策,2015,02:246-250.
[28]易丹.四川省氮氧化物排放现状及控制对策研究[D].西南交通大学,环境工程,2013,硕士.
[29]周祎凝.奥巴马和希拉里政治语篇中概念隐喻对比研究[D].湖南科技大学,外国语言文学,2013,硕士.
[30]章坚民,赵舫,马传思.嵌入式变电站智能信息集成与数据服务器的设计与开发[J].电力系统自动化,2005,09:50-54.
[31]刘杰.B2C模式下大学生网购选择的影响因素研究[D].云南财经大学,企业管理,2013,硕士.
[32]禹美凤.基于柔性靠泊的集装箱港口泊位和岸桥的调度优化[D].浙江工业大学,2013.
[33]寇欣,尹成群,吕安强,李永倩.基于BOTDR监测数据的光纤复合海底电缆状态预测[J].电测与仪表,2015,03:48-53.
[34]丁雅婷.联邦快递和顺丰快递竞争优势比较分析[D].大连理工大学,物流工程（专业学位）,2013,硕士.
[35]王瑞.社会转型期大学生思想道德建设研究[D].山西财经大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[36]李运霞.一类分数阶微分方程的精确求解方法[D].黑龙江大学,应用数学,2013,硕士.
[37]欧阳翼.深圳ZJ公司精细化管理应用研究[D].广东工业大学,工商管理,2013,硕士.
[38]余雪.书评与新闻纸的联动效应[D].复旦大学,新闻学,2012,硕士.
[39]李长生,张合,曹娟,刘明.磁共振耦合电能传输系统功率与效率传输特性分析与优化[J].电力系统自动化,2015,08:92-97.
[40]王燕华.基于动态子结构法的异形桥梁动力特性研究[D].吉林大学,道路与铁道工程,2014,硕士.
[41]李靖.改性水热法合成高性能LiFePO_4正极材料[D].苏州大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[42]李洋.信号完整性分析在现代智能手机上的应用[D].华东理工大学,电子与通信,2013,硕士.
[43]赵晓明,吴胜和,岳大力,朱文春,张跃龙,刘丽.老油田浅层声波曲线的预处理与重构技术[J].石油地球物理勘探,2010,04:559-564+624+469.
[44]刘廷敏.四川机电职业技术学院教学质量评估系统设计与软件开发[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[45]赵丹妮.美日现代成本管理的比较研究[D].对外经济贸易大学,会计学,2004,硕士.
[46]赵春宝,汪信,杨绪杰.碳纳米材料在导热聚合物复合材料中的应用[J].电子元件与材料,2012,01:78-82+86.
[47]翟中伟.我国货币政策数量及时间效应实证研究（1996年—2003年）[D].广西大学,金融学,2004,硕士.
[48]李珊珊.高速DSP的电视图像跟踪系统的设计与实现[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[49]刘娟.生态批评视域下的《鱼王》[D].新疆大学,俄语语言文学,2013,硕士.
[50]裴国强.论董事责任保险[D].江西财经大学,经济法,2004,硕士.