靶除肌抑素基因体细胞克隆蒙古羊的研究
【摘要】近几年发现的抑制骨骼肌生长的负调控因子–肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN),在遗传突变后,导致基因功能的失活,进而引起动物肌肉过度发育,肌纤维数量增多,直径增加,肌肉量急剧增加,动物表现为“双肌”眭状。于是,研究者们通过对肌抑素基因进行敲除、缺失,突变等基因修饰,来获得基因敲除的动物模型和克隆动物,以达到医学上和农业上的需求。对于本研究来说,蒙古羊是内蒙古自治区的优势物种之一,培育产肉性状优良,产肉率高的蒙古羊对于自治区的家畜育种具有重要意义。本研究选用妊娠30天的蒙古羊胎儿为材料,通过组织块贴壁法成功建立蒙古羊胎儿成纤维细胞系,用于MSTN基因的打靶实验。同时利用基因敲除技术在体外构建了针对蒙古羊MSTN基因的第三外显子缺失的敲除载体。主要构建了两个带有筛选标记的置换型载体和一个无筛选标记的TALEN敲除载体。主要结果如下1、委托华大基因测序公司对蒙古羊肌抑素基因进行测序,得到测序结果后与Genebank上发布的Ovies的MSTN基因序列进行比对,设计引物,成功克隆出蒙古羊肌抑素基因。2、设计引物,利用PCR技术,成功扩增到蒙古羊MSTN基因的两种同源长臂,大小分别为5600bp和6000bp,包括全部的exonl,intron1,exon2,intron2及部分启动子和少部分exon3同源短臂1100bp,包括部分exon3和3’非翻译区序列,然后将同源长短臂分别连入代有正负筛选标记基因的pPNTⅢ和pEGF-N1的敲除骨架载体,分别用TA克隆法和无缝克隆法成功构建了针对MSTN基因第三外显子缺失的置换型打靶载体,且酶切和测序鉴定均证明两种置换型载体构建都正确。3、构建了两个针对蒙古羊肌抑素基因第三外显子中的17个碱基突变的无筛选标记的TALEN载体(197和198)和一个针对第二外显子中的17个碱基突变的TALEN载体(199)。通过活性鉴定,验证只有两个具有敲除活性的TALEN载体(197和198)。4、通过组织块贴壁法建立蒙古羊胎儿成纤维细胞系,且细胞系的生长状态良好。将置换型载体和TALEN载体分别利用电转染和LipofectamineTM2000介导的脂质体转染蒙古羊胎儿成纤维细胞。通过药物G418筛选和无限稀释一口习惯法筛选单克隆细胞,并将得到的单细胞株部分用于鉴定是否敲除,部分冻存。之后,对筛选的单细胞株提取DNA,PCR,鉴定。将最终鉴定正确的20个TALEN基因敲除细胞株再次分别做PCR,将得到的PCR产物(即在第三外显子包括靶位点的一段基因序列)连接到pMD-191上菌落PCR,每个细胞株将随机挑选15个单菌落样品送测序，再一次鉴定是否在靶位点处有碱基的突变。最终的测序证明197中有4个双等位基因缺失碱基的细胞株,而198中只有3个细胞株发生单碱基突变或缺失。5、选择用筛选出来的双等位基因缺失的单克隆细胞株E20、P54、P66和P42(在靶位点附近分别缺失碱基19个、11个、8个和11个)做为供体细胞,成熟的卵母细胞去核后做为受体细胞,通过显微注射法构建了基因敲除的克隆重构胚,再进行胚胎移植。结果为：四种不同的细胞株共移植61只受体绵羊。经B超检测,共妊娠20只羊。6、现已出生基因敲除羔羊共11只,已检测其中4只,2只为双等位基因敲除羔羊(缺失碱基19bp),2只为单等位基因敲除,7只正在鉴定中,余2只受体待产。
【作者】赵瑞媛；
【导师】周欢敏；
【作者基本信息】内蒙古农业大学，动物发育生物学与生物技术，2014，博士
【关键词】蒙古羊；MSTN；遗传育种；基因打靶；克隆；基因敲除细胞；
【参考文献】
[1]黄贵龙.概念设计阶段前纵梁弯曲特性研究[D].吉林大学,固体力学,2014,硕士.
[2]李小娟,冯彦民.建设ERP系统加强效能监察工作[J].冶金自动化,2006,02:68.
[3]王海燕.基于模糊元胞自动机的电子口碑演化模型研究[D].宁波大学,企业管理,2014,硕士.
[4]胡奇锋.永磁同步电机高性能调速控制系统研究[D].浙江大学,2004.
[5]杨丹.大庆市大同区土地利用转型研究[D].东北农业大学,农业遥感与土地利用,2013,硕士.
[6]魏南枝.美国贸易保障措施研究[D].清华大学,民商法学,2003,硕士.
[7]程聪,谢洪明,陈盈,程宣梅.网络关系、内外部社会资本与技术创新关系研究[J].科研管理,2013,11:1-8.
[8]郭丽君.肖恩奥凯西民族身份的构建与重构：1880-1916[D].上海外国语大学,英语语言文学,2012,硕士.
[9]孙奇珍,蔡泽祥,李爱民,李力,吴科成.500kV电网短路电流超标机理及限制措施适应性[J].电力系统自动化,2009,21:92-96.
[10]李小庆.五城兵马司与明代京师治安管理[D].东北师范大学,亚洲文化研究,2012,硕士.
[11]陈悦.高层建筑对大跨柱面屋盖的风致干扰效应[D].北京交通大学,结构工程,2013,硕士.
[12]陆静.大豆疫霉bZIP转录因子PsBZP1的功能研究[D].南京农业大学,植物病理学,2012,硕士.
[13]孟祥吉,燕瑛,罗海波,侯康,梁祖典,宫少波.复合材料波纹梁冲击试验与数值模拟[J].复合材料学报.
[14]李先之.光在商业空间应用与研究[D].湖南师范大学,设计艺术学,2013,硕士.
[15]姚峰.水下机器人基础运动控制体系结构及运动控制技术研究[D].哈尔滨工程大学,机械电子工程,2012,硕士.
[16]万艳军.语体视野下的《大唐西域记》副词研究[D].新疆师范大学,汉语言文字学,2014,硕士.
[17]赵先花.文冠果油的提取与组分分析[D].长春工业大学,食品科学,2013,硕士.
[18]林显东.高校志愿者文化视野下的大学生思想政治教育研究[D].黑龙江大学,思想政治教育,2013,硕士.
[19]王俊珍.新形势下保持党的纯洁性研究[D].喀什师范学院,马克思主义基本原理,2014,硕士.
[20]王圣虎.技术侦查措施理论与应用研究[D].西南政法大学,侦查学,2012,硕士.
[21]李亚敏,吴淑芳,冶保献.硫酸特布他林在聚L-精氨酸/石墨烯/Nafion修饰电极上的电化学行为及其测定研究[A].河南省化学会.河南省化学会2012年学术年会论文摘要集[C].河南省化学会:,2012:1.
[22]吕建国.循环图C（n；1，k）的交叉数[D].大连理工大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[23]闻爱华.基于半色调图像的抗打印扫描数字水印算法研究[D].北京印刷学院,信号与信息处理,2013,硕士.
[24]巴达楞贵.蒙古族传统体育的起源、演变及文化价值探索[D].内蒙古师范大学,民族传统体育学,2013,硕士.
[25]梁顺军,张晓斌,肖宇,欧阳明华,李乐,屈伯章,蒲平文,江巍,王身健.地震解释井位跟踪分析[J].石油地球物理勘探,2012,02:315-322+185.
[26]陈宇飞.机电伺服系统鲁棒控制设计与实现[D].哈尔滨工业大学,控制科学与工程,2014,硕士.
[27]王连运.颅脑损伤患者CRP、D-二聚体的变化及临床意义研究[D].青岛大学,神经外科学,2013,硕士.
[28]刘瑶.海上保险代位求偿权行使法律问题研究[D].首都经济贸易大学,经济法,2013,硕士.
[29]韩旭.高温耐火涂层的研究—溶胶凝胶法制备耐高温绝缘涂层[D].大连工业大学,材料学,2008,硕士.
[30]蒋华.财税激励政策与企业R&D投入的相关性研究[D].杭州电子科技大学,会计学,2013,硕士.
[31]常战芳,安丰涛.宣钢光纤主干网设计及实施[J].冶金自动化,2004,01:74.
[32]黄建农.随车起重机产品市场容量分析[D].南京理工大学,2002.
[33]刘伟达.基于聚合物膜的仿生离子通道的制备及性质研究[D].河北大学,物理化学,2014,硕士.
[34]严杭晨,汤一平,马宝庆,田旭园,吴立娟.基于全方位视觉的多目标跟踪技术[J].计算机系统应用,2013,09:185-190.
[35]章圣闯.基于B/S模式的小型连锁商店管理系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[36]王存荣.济南志亨公司发展战略研究[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[37]陈发伟.苏北欠发达地区软件园发展战略研究[D].华东理工大学,公共管理（专业学位）,2014,硕士.
[38]王振一.7A09铝合金半固态浆料的流变剪切制备技术研究[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2014,硕士.
[39]张淑红.论刑罚执行监督存在的问题与完善[D].曲阜师范大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[40]王成尧,高麟,汪定伟.模糊加工时间单机E/T调度问题的GA算法[J].控制与决策,1998,S1:34-38+43.
[41]周梁毅.我国城市居家养老服务社会化问题研究[D].华侨大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[42]胡斌.miRNA-125b-1对乳腺癌SKBR-3细胞放化疗敏感性的影响[D].南方医科大学,普通外科学,2012,硕士.
[43]顾见军.网格Portal的设计与实现[D].四川大学,2003.
[44]刘万宗.基于有限元理论对挤出机螺旋绞刀的优化[D].山东建筑大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[45]李凌浩,林鹏,王其兵,贺金生,何建源,刘初钿,金昌善,陈仁华.武夷山甜槠林水文学效应的研究[J].植物生态学报,1997,05:2-11.
[46]高娃.蒙古族幼儿舞蹈课程资源开发与利用研究[D].内蒙古师范大学,学前教育学,2012,硕士.
[47]邓辉.基于MODIS数据的大区域土壤水分遥感监测研究[D].中国农业科学院,环境工程,2004,硕士.
[48]张拓.大调解体系下的人民调解问题研究[D].甘肃政法学院,法律,2012,硕士.
[49]刘晓.基于Malmquist指数的江西省农业生产效率实证分析[D].江西财经大学,国民经济学,2013,硕士.
[50]金磊.新世纪不要让悲剧再重演——写在唐山“728”大地震25周年祭日的思考[J].世界科技研究与发展.2001(04)
