靶除FGF5基因体细胞克隆绒山羊的研究

【摘要】FGF5基因是FGF基因家族中的一员,在毛发生长周期中具有重要的调控作用。FGF5基因突变可以导致毛发生长周期中生长期的延长,从而使毛发的长度增加。本研究拟靶除内蒙古白绒山羊的FGF5基因,利用核移植方法创造高产绒量山羊。以我区的白绒山羊为对象,建立胎儿皮肤成纤维细胞系；设计pLOX-EGFP-FGF5、RNAi-FGF5、TALEN-FGF5,三种FGF5基因靶除载体；分别将三种敲除载体用脂质体介导法、电转法、转染仪介导法转染到绒山羊胎儿成纤维细胞中,筛选阳性细胞并扩繁；以其为核供体构建转基因山羊重构胚并移植到同步发情的受体羊输卵管内,制造转基因克隆山羊并鉴定。1.根据已经公布的牛和山羊的FGF5基因序列设计引物克隆内蒙古白绒山羊的FGF5基因,发现FGF5基因具有三个外显子和两个内含子,cDNA长度为924bp。根据基因序列设计并构建合成3种靶除绒山羊FGF5基因的载体,分别为基因打靶载体pLOX-EGFP-FGF5,RNA干扰载体RNAi-FGF5-1#和RNAi-FGF5-2#,以及TALEN载体TN000201、TN000202、TN000204。测序及酶切鉴定结果表明载体构建正确并可用。2.采用组织块种植法分离培养了9个绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞系；通过G418敏感度实验,确定了各个细胞系的最佳G418筛选浓度,并选择对G418抗性较好的两个细胞系goat6#和goat9#作为筛选转基因阳性细胞的细胞系；分别应用脂质体介导法、电转法、转染仪介导法将3种载体转染到绒山羊胎儿成纤维细胞中,最终筛选出3种转基因阳性细胞系。3.以筛选鉴定得到3种转基因阳性细胞系为核供体,分别构建转基因克隆胚胎。应用基因打靶技术敲除FGF5基因的转基因克隆胚共同步移植46只受体山羊,妊娠4只,妊娠率为8.7%。1只羔羊存活4天后死亡,2只羔羊出生后几分钟死亡,目前健康存活羔羊1只。应用RNA干扰技术沉默FGF5基因的转基因克隆胚共同步移植143只受体山羊,妊娠24只,妊娠率为16.78%,但胎儿均发生流产。应用TALEN技术敲除FGF5基因的转基因克隆胚共同步移植62只受体山羊,经B超检测发现有5只受体羊怀孕,妊娠率为8.06%。4.应用基因打靶技术敲除FGF5基因的转基因克隆羔羊经PCR鉴定,检测出编号为083的羔羊发生了FGF5基因的双敲除,目前健康状况良好。其余三只羔羊为非转基因的克隆羊。在应用RNA干扰技术沉默FGF5基因中,通过实时荧光定量PCR对流产胎儿进行鉴定,结果表明这些胎儿FGF5基因的表达量均发生了明显的降低。应用TALEN技术靶除FGF5基因的转基因克隆羔羊,经PCR产物测序鉴定,结果表明4只新生羔羊FGF5基因的靶标区域均缺失了两个碱基,造成了FGF5基因的移码突变。
【作者】王丙萍；
【导师】周欢敏；
【作者基本信息】内蒙古农业大学，动物发育生物学与生物技术，2014，博士
【关键词】FGF5；基因打靶；RNAi；TALEN；绒山羊；

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