DNA2和TATDN1在细胞核和线粒体内的功能及调控

【摘要】DNA2是一种核酸酶／解旋酶,首先在酵母中被发现。作为重要的工具酶在DNA复制和修复中,参与不同的信号通路。例如在冈崎片段成熟过程中能够去除RNA引物,双链DNA断裂修复中进行末端剪切,以及最近报道的,DNA2能够稳定并重新起始鸡爪状复制叉。2008年,我们实验室首先发现人DNA2也具有保守的核酸酶和解旋酶结构域,但是缺少经典的核定位信号肽序列。所以免疫荧光和蛋白杂交实验表明,人DNA2主要定位在线粒体内而非细胞核内。体外生化实验表明,人DNA2能够移除线粒体DNA复制过程中形成的RNA引物并促进poly合成DNA的效率。此外,人DNA2也能够参与长片段碱基切除修复过程中翼状结构的移除,从而稳定极易受到氧自由基攻击的线粒体DNA。与上述结果一致,2013年,我们与一个意大利实验室合作共同报道,一些家族性肌无力肌病患者样本中携带有几个DNA2基因的突变位点,这些位点在氨基酸水平上都是非常保守的。我们表达并纯化这些突变体,体外实验分析发现,它们具有核酸酶或者解旋酶缺陷。因此,我们推测DNA2突变很可能直接或间接导致线粒体肌病。接下来,我们通过基因靶向技术构建了DNA2敲除小鼠模型。结果发现,所有的DNA2纯和敲除小鼠都是胚胎致死的,说明DNA2对于胚胎发育是必须且至关重要的,但是DNA2杂合敲除是可以存活的。让我们惊讶的是,虽然小鼠DNA2的入核信号序列也全部丢失,但是,DNA2杂合敲除小鼠表现出明显的端粒复制缺陷,例如端粒丢失,端粒断裂以及姐妹端粒互联等。体外实验表明,DNA2可以特异切割由端粒特殊重复序列TTAGGG形成的G4四联体结构,并且用G4结构稳定剂处理MEF细胞发现,这种G4结构在DNA2杂合敲除小鼠MEF细胞中更加稳定。此外,DNA2缺失会导致端粒损伤和染色体分离错误,从形成多倍体细胞。并且在DNA2杂合敲除小鼠癌症细胞中发现大量功能紊乱的端粒。翻译后修饰对于蛋白的功能调节起到重要的作用。有报道称,酵母DNA2的磷酸化可以招募DNA2到损伤位点进行DNA修复,但是关于哺乳动物DNA2的翻译后修饰还鲜有研究。当DNA受到损伤时,修复相关的蛋白被激活并富集到损伤位点进行DNA修复。本文研究了DNA2的泛素化,数据表明,DNA2与E3连接酶相互作用并被其泛素化(多聚泛素化),泛素化后的DNA2十分稳定不被蛋白酶体降解,并且我们推测,泛素化的DNA2能够帮助DNA2转运到核内进行DNA损伤修复。斑马鱼TATDN1(zTATDN1)具有内切核酸酶活性。体外生化分析,zTATDN1能够切割双链环状DNA,形成DSB。这种生化活性使得zTATDN1能够解离缠绕的kDNA成为线性DNA。进一步研究表明,zTATDN1与斑马鱼胚胎的眼睛发育有关。当降低zTATDN1的表达量会引起细胞周期异常,进而形成多倍体细胞,引起眼睛发育迟缓,偏小。
【作者】刘长伟；
【导师】沈炳辉；
【作者基本信息】浙江大学，生物物理学，2014，博士
【关键词】DNA2；G4-quardruplex；端粒；癌症；泛素化；

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