饭豆MATE基因功能及其表达调控机制研究

【摘要】铝毒害是酸性土壤上限制作物生长的主要因子。植物在适应酸性土壤环境的过程中已形成一套自身的调控机制,其中铝诱导的根尖有机酸分泌是重要的耐铝机理。饭豆的耐铝性与其根尖具有铝诱导分泌柠檬酸的特性相关,前期研究中,我们通过同源克隆的方法,得到了一个位于质膜上的柠檬酸转运蛋白编码基因VuMATE1,并发现该基因与其他报道的铝胁迫柠檬酸分泌相关的MATEs相比具有受铝诱导和根尖表达的特殊性,而关于铝胁迫下VuMATE1表达和柠檬酸分泌具体调控机制还并不清楚。本研究主要以饭豆铝胁迫下柠檬酸分泌调控机制及饭豆MATE蛋白功能为研究内容,研究结果如下：1.铝诱导饭豆跟尖VuMATE1表达和柠檬酸分泌调控机理初探铝激活的柠檬酸的分泌在植物耐铝机制中起着重要作用。本研究进一步揭示了铝激活的柠檬酸转运子VuMATE1的调控特性。铝诱导VuMATE1表达之后才伴随着柠檬酸分泌的增加。铝胁迫下柠檬酸的分泌具有特异性,而铝对VuMATE1的诱导表达并没有专一性,VuMATE1还受La的诱导表达。蛋白合成抑制剂的预处理能够抑制VuMATE1的表达,说明蛋白的重新合成在VuMATE1基因表达过程中是必须的。铝处理之后再进行蛋白合成抑制剂的处理柠檬酸的分泌被抑制.,说明VuMATE1转录后调控对铝胁迫下柠檬酸的分泌是非常重要的一步。蛋白激酶和磷酸酶抑制剂的处理表明可逆的磷酸化作用不仅在转录水平上影响着VuMATE1的表达,同时在转录后调控水平上调节着VuMATE1蛋白活性。上述结果说明柠檬酸的分泌依赖于VuMATE1基因转录及转录后水平的调控。此外,VuMATE1启动子连GUS的转基因株系铝处理后GUS染色分析进一步揭示了VuMATE1在根尖受铝诱导表达,推测在它的启动子区存在根尖特异、铝响应顺式作用元件。通过分离上述元件可丰富植物耐铝遗传改良资源。2.VuMATE1启动子根尖特异、铝响应顺式作用元件的分离我们采用染色体步移法克隆到VuMATEl起始密码子上游约2Kb的序列,并通过5’RACE技术确定了转录起始位点为A。顺式元件在线分析软件PlantCARE和PLACE分析结果表明该启动子上存在许多胁迫响应元件,其中包括多个已报道的ART1顺式作用核心元件GGN(T/g/a/c)V(C/a/g)S(C/G).根据ART1元件所在位置,我们构建了包括全长启动子在内的10个启动子片段连接GUS的表达载体,通过拟南芥花序真空浸润法转到野生型拟南芥Col-0中,所获得的纯合转基因株系有..1720P::GUS2个、-1720P-Intron::GUS(内含子缺失)2个、-1330P::GUs10个、一1269P::GUS2个、-1228P::GUS9个、-624P::GUS8个、-574P:GUS8个、-254P::GUS3个、-192P::GUS3个和-115P::GUS6个。将上述转基因材料进行铝处理GUS染色分析,发现根尖特异、铝响应元件存在于-1228到-574的启动子片段中。将上述候选序列分成A1、A2和A3三段与已报道的能和ART1顺式元件互作的ART1同源蛋白VuSTOP1转录因子进行酵母单杂交验证,结果发现含有ARTl核心元件的A1、A2片段并不能和VuSTOP1互作,而不含有上述核心元件的A3片段却能与VuSTOP1微弱互作。上述结果预示着我们分离到的候选序列中可能存在新型的铝响应顺式作用元件,另外根尖特异和铝响应元件有可能为同一序列亦或者分属于不同的片段。3.VuMATE1在饭豆铁营养中的功能研究以往研究表明柠檬酸转运蛋白MATEs具有向根尖分泌柠檬酸解除铝毒害作用和改善铁的利用效率的双重功能。我们发现铝诱导和激活的饭豆柠檬酸转运蛋白VuMATEl在根成熟区维管组织中是组成型表达,预示其可能参与饭豆缺铁响应机制。我们通过VuMATE1p2Kb::GUS拟南芥转基因株系GUS染色分析,发现VuMATE1在整个植株的维管系统中表达,而不在维管组织还没发育完全的根尖表达。VuMATE1p2Kb:GFP转基因株系荧光检测也发现,在根尖部分铝处理之后才能观察到荧光,同时在根成熟区的根毛、表皮及维管系统中VuMATE1表达较弱,且受铝诱导程度较弱。然而,我们将VuMATE1p2Kb::VuMATE1::GFP表达载体导入拟南芥不能转运铁的frd3-1突变体中进行回复试验发现,两个回复株系的表型并没有得到回复。采用免疫染色法对VuMATE1在饭豆活体根、茎、叶中进行细胞特异性定位发现,VuMATE1蛋白定位在靠近木质部导管、皮层最外层以及表皮细胞中。另外,缺铁处理下,饭豆根系柠檬酸分泌量和VuMATE1表达均无多大变化。上述结果说明VuMATE1表达变化是为了使饭豆更好的适应酸性土壤环境而可能与铁营养无关。4.VuMATE2的克隆和功能研究在差减杂交库中获得的基因片段的基础上,我们采用RACE技术克隆到饭豆另一个MATE基因VuMATE2,该基因cDNA全长2097bp包含一个1605bp的开放阅读框,编码534个氨基酸。基因结构分析表明该基因含有14个外显子和13个内含子。与已报道的柠檬酸转运蛋白一样,VuMATE2包含12个跨膜结构域,定位在细胞质膜上。进化分析表明它与拟南芥AtMAIE和玉米ZnMATE1处于同一分支上而与饭豆VuMATEl处于不同的分支,说明VuMATE2可能在功能上与VuMATE1不同。在饭豆中的表达模式分析显示,VuMATE2在根尖0-1cm组成型表达,铝处理2hVuMATE2表达增强；而在根1-2cm区段及叶片中的本底表达水平均特别低；不同金属离子处理时,只有铝能诱导VuMATE2表达增强。另外,VuMATE2的拟南芥超表达株系和AtALMT1-KO/AtMATE-KD双突变体的回复株系耐铝性均有所提高。因此,VuMATE2可能在饭豆铝胁迫初期起着一定的解铝毒作用,且可能与VuMATEl有着不同的调控通路。
【作者】刘美雅；
【导师】郑绍建；杨建立；
【作者基本信息】浙江大学，植物学，2014，博士
【关键词】饭豆；铝毒害；启动子；顺式作用元件；柠檬酸转运蛋白MATEs；

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