白菜花粉壁发育相关基因的表达分析与功能验证

【摘要】植物花粉壁在植物花粉发育过程中起着重要作用。其由花粉内壁和外壁组成。花粉壁的存在有助于保证小孢子内部结构的完整、保护花粉粒中易受光、热和空气等因素破坏的物质及防止病菌的侵害。花粉壁中含油层的物质在花粉与雌蕊组织之间的识别或拒绝的过程中起作用,该作用是通过花粉壁上的蛋白质和柱头乳突细胞表面的蛋白质之间的相互作用来实现的。本文以白菜(BrassicacampestrisL.ssp.chinensisMakino,syn.B.rapassp.chinensis)‘矮脚黄’核不育(’Aijiaohuang’genicmalesterility,ajhGMS)两用系’Bcajh97-01A/B’为材料,分离和(或)鉴定了白菜3个花粉壁发育相关的基因BcMF19、BcAGP23和BcBGAL11。通过构建BcMF19的反义RNA载体,对菜心(B.campestrisssp.chinensisvar.parachinensis(Bailey)TsenetLee)进行转化,获得该基因功能缺失转基因植株,从而分析其在花粉发育进程中的生物学功能；通过PCR扩增方法对白菜BcAGP23和BcBGAL11基因的基因组全长和cDNA全长进行了克隆、鉴定以及蛋白结构和功能的预测；同时采用qRT-PCR和原位杂交方法对BcAGP23和BcBGAL11的时空表达模式进行了探究；通过构建人工nicroRNA载体,并对菜心进行转化,获得了的BcAGP23基因功能缺失转基因植株,从而分析其在花粉发育进程中的生物学功能；以白菜数据库(BRAD)为依托,全基因组分析得到16条白菜BGAL基因共计27个基因拷贝数,对基因的每个拷贝进行了启动子顺式作用元件、进化树构建、在不同组织和器官的表达等分析,取得的结果主要结果如下：(1)利用反义RNA技术构建了BcMF19反义沉默的白菜转基因植株,并将转基因植株命名为35sbcmfl9。与对照相比,35sbcmfl9的雌蕊、长短花药的形态明显受到影响；DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)对花粉粒染色时35sbcmfl9和对照中均能发现2个精核和1个营养核；亚历山大染色花粉活力统计结果显示对照中96%的花粉粒具有活性,而35sbcmfl9中只有86%；扫描电镜观察花粉形态发现35sbcmfl9中有大量形如柿饼的畸形花粉粒,正常花粉粒比例18%；采用透射电镜观察时发现35sbcmfl9二核和成熟花粉粒时期的花粉内壁表现出异常增厚,异常增厚现象在萌发沟处更加明显；35sbcmfl9的花粉体外萌发时其花粉管伸长到一定长度后变成球状并停止伸长,同时其花粉体内萌发实验结果也表明BcMF19的功能缺失可以影响花粉管在雌蕊中的延伸。(2)从白菜‘矮脚黄’核隐性不育两用系的可育株系中成功克隆了花粉发育特异基因的阿拉伯半乳糖蛋白基因BcAGP23的DNA全长和cDNA序列。BcAGP23只有一个外显子,无内含子,最大开放阅读框为186bp,编码61个氨基酸。qRT-PCR和原位杂交结果表明,在可育株系的Ⅲ级花蕾中的小孢子中开始表达,并随着花粉发育,表达量不断增加。(3)利用人工microRNA技术构建了BcAGP23的基因功能缺失转基因植株,并将转基因植株命名为bcagp23。与对照相比,bcagp23的长短花药的形态明显受到影响；DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)对花粉粒染色时bcagp23和对照中均能发现2个精核和1个营养核;亚历山大染色花粉活力统计结果显示对照中97%的花粉粒具有活性,而bcagp23中只有90%；扫描电镜观察花粉形态发现bcagp23中有大量塌陷的畸形花粉粒,正常花粉粒比例12%；采用透射电镜观察时发现bcagp23二核和成熟花粉粒时期的花粉内壁表现出异常均匀增厚,花粉内壁增厚现象一直能延续到成熟花粉粒时期。(4)从白菜‘矮脚黄’核隐性不育两用系的可育株系中成功克隆了花粉发育发育特异基因的B-半乳糖苷酶基因BcBGAL11的DNA全长和cDNA序列。BcBGAL11含有17个外显子,16个内含子,最大开放阅读框为2511bp,编码836个氨基酸。qRT-PCR和原位杂交结果表明,在可育株系的Ⅲ级花蕾中的小孢子中开始表达,在Ⅳ级花蕾中相对表达量达最大值,V级花蕾时表达量稍有下降。采用plantcare分析其启动子序列时,发现启动子序列含有ARE(厌氧诱导相关元件),HSE(高温胁迫相关元件),MBS(MYB结合位点与干旱诱导相关元件),TC-richrepeats(胁迫反应相关元件)和TCA-element(水杨酸反应相关元件)顺式作用元件。(5)植物BGALs参与到细胞壁的生物合成与修饰,并且是由一个多基因家族编码的。全基因组分析发现白菜中含有16条BGALs共计27个拷贝。每个拷贝的启动子序列中均含有许多已知的与胁迫和激素响应等相关的顺式作用元件.qQT-PCR分析不同基因的表达水平发现至少能在一个组织中检测到其表达量,部分基因还表现出表达的组织特异性,如BcBGAL11、BcBGAL13和BcBGAL15在可育株的花中特异表达；BcBGAL7、BcBGAL11、BcBGAL13和BcBGAL14在可育株的花药中特异表达。
【作者】刘金龙；
【导师】曹家树；
【作者基本信息】浙江大学，蔬菜学，2013，博士
【关键词】白菜；多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白；花粉发育；花粉壁；阿拉伯半乳糖蛋白；β-半乳糖苷酶；

【参考文献】
[1]宋海声.快速开采最大频繁项目集[J].计算机应用研究,2004,03:45-46.
[2]马丽.大连成大方圆运用CRM提高顾客满意度的研究[D].大连理工大学,2004.
[3]陈炜.显微红外原位研究聚丙烯、聚丁烯及其共混物的结构与性能关系[D].中国科学技术大学,同步辐射及应用,2014,博士.
[4]陈艳霞.寿光市农民专业合作社管理模式研究[D].西北农林科技大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[5]邹昊.猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白亲和多肽的筛选与鉴定[D].东北农业大学,预防兽医学,2013,硕士.
[6]万志高.项目成本管理在高校用户移动互联网业务推广项目中的应用[D].南京邮电大学,项目管理（专业学位）,2012,硕士.
[7]蒋琢晖.高压共轨系统齿轮泵轴向间隙装配检测装置的开发[D].南京理工大学,车辆工程,2013,硕士.
[8]张永强.煤炭开采过程中构造煤对碳排放的影响研究[D].中国矿业大学,矿产普查与勘探,2014,硕士.
[9]吉珍霞.当代中国“知识分子的公共性”研究[D].西安科技大学,马克思主义理论,2014,硕士.
[10]宋兴兴.猕猴桃白兰地的发酵工艺研究[D].重庆大学,生物学,2014,硕士.
[11]杨沛,郑启伦,彭宏,李颖基.PFTM:一种基于投影的频繁子树挖掘算法[J].计算机科学,2005,02:206-209.
[12]蒲苗苗.基于Landsat数据的西安市热岛效应研究[D].长安大学,农业资源利用（专业学位）,2014,硕士.
[13]陈家怡.都市中的沙发客[D].华东师范大学,社会学,2013,硕士.
[14]林国学.项目投标及合同的风险管理[D].西安建筑科技大学,建筑与土木工程,2004,硕士.
[15]曹宏桥.海港码头工程的EPC组织与实施[D].天津大学,水利工程,2013,硕士.
[16]范磊.陕西省污染产业承接规避研究[D].西安石油大学,产业经济学,2012,硕士.
[17]张德华,刘士海,任少强.高地应力软岩隧道中型钢与格栅支护适应性现场对比试验研究[J].岩石力学与工程学报,2014,11:2258-2266.
[18]康琳琳.Z银行锦州支行中小企业信贷业务发展研究[D].大连理工大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[19]杨怀谷.猪ETEC F4ac受体编码基因MUC13的拷贝数及其在不同黏附表型个体中的表达分析[D].江西农业大学,动物遗传育种与繁殖,2012,硕士.
[20]雷利芳.覆盆子的抗氧化活性及其与化学成分和显微特征常数的相关性研究[D].郑州大学,药物分析学,2013,硕士.
[21]赵国鹏,林少伯,韩民晓.基于补偿特性的并联型有源电力滤波器直流侧电压取值分析[J].电力系统自动化,2012,14:83-87.
[22]张华.LQG/LTR方法在涡扇发动机控制中的应用研究[D].西北工业大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[23]田甜.抗战时期中共在职干部教育与马克思主义中国化[D].天津商业大学,马克思主义中国化研究,2013,硕士.
[24]姚瑶.石油降解菌的筛选及其环己酮代谢途径研究[D].南京农业大学,海洋生物学,2012,硕士.
[25]李姗姗.水泥石碳化性能的影响因素及其机理研究[D].重庆大学,材料科学与工程,2014,硕士.
[26]叶春芳.光学系统MTF快速测量仪的研究[D].浙江大学,2006.
[27]战宏.中国影子银行监管问题研究[D].吉林大学,金融,2013,硕士.
[28]陈路锋.高速铁路客流分配与列车开行方案评估一体化技术研究[D].北京交通大学,2013.
[29]张惠源.非指导性教学理论在中学音乐教学中的应用[D].曲阜师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[30]卫晓燕.现状问题对策—一对建立多样化的教师培训模式，促进教师专业化发展初探[D].上海师范大学,教育,2004,硕士.
[31]张众正.批量反作用飞轮的力矩优化分配策略与容错控制[D].哈尔滨工业大学,航天工程,2014,硕士.
[32]田美玲.我国中产阶层发展问题研究[D].山西财经大学,马克思主义中国化,2013,硕士.
[33]徐小荟.佛教对镰仓时代日本社会的影响[D].西北大学,日语语言文学,2013,硕士.
[34]李湘祁.美国女子成才障碍研究的现状与趋势[D].首都师范大学,比较教育学,2004,硕士.
[35]钱鑫.苏州构建多元主体协同创建文明城市路径的探索及其完善[D].苏州大学,行政管理,2013,硕士.
[36]王晓坤.β动力系统的基本性质研究[D].华中科技大学,基础数学,2013,硕士.
[37]孟琳雅.用于胆甾型双稳显示的混合PI取向膜的研究[D].大连海事大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[38]朱海玲.基于倍频和延时自外差的光生微波方法研究[D].西南交通大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[39]林青.高速公路拓宽道路差异沉降特性研究[D].长安大学,项目管理（专业学位）,2014,硕士.
[40]唐毅.电能计量装置远程校验监测系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[41]张鸿烈.叠前地震速度谱信息与油气关系研究及实例[J].石油地球物理勘探,1996,S1:21-27+58-147.
[42]王延平.C2C交易税收法律制度研究[D].重庆大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[43]张国云.数据挖掘中的聚类分析及其在控制中的应用研究[D].湖南大学,2002.
[44]李荣风.自我概念、母亲抑郁与青少年焦虑/抑郁之间的关系[D].山东师范大学,发展与教育心理学,2013,硕士.
[45]李大伟.论刑事诉讼中的立案监督[D].安徽大学,法律,2012,硕士.
[46]曹晓东.普通高等院校体育教学模式改革的探讨与研究[D].山东体育学院,体育教学,2011,硕士.
[47]赵志鹏.电沉积镍箔的高温成形性能研究[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2013,硕士.
[48]夏坪,刘华彦,陈银飞.稀土元素(Y、Nd、Ce、La)改性NaY分子筛催化乳酸脱水制丙烯酸[J].工业催化,2013,02:38-43.
[49]吴婷.预算软约束下财务困境上市公司的过度投资行为研究[D].武汉纺织大学,企业管理,2014,硕士.
[50]INTANAIADCHARIYA.中国游客旅游动机、满意度与忠诚研究[D].北京交通大学,旅游管理,2013,硕士.