褐飞虱致害性变异相关机理研究

【摘要】褐飞虱Nilapararvatalugens(Stal)属半翅目Hemiptera,飞虱科Delphacidae,是我国及亚洲其它稻区的主要害虫。种植抗性品种一直是防治褐飞虱的一种重要措施。然而,褐飞虱致害性的快速与高度变异往往造成抗虫品种使用年限缩短。而褐飞虱的致害性变异规律目前并不清楚。有研究表明,共生菌、唾液蛋白以及昆虫解毒酶类等在植食性昆虫致害性变异中发挥着重要作用。为此,本文以褐飞虱Mudgo和TN1两种致害性种群为研究对象,以具有解毒功能和存在共生菌的脂肪体及唾液分泌蛋白为研究切入点,通过比较两个种群脂肪体转录组的差异,寻找与褐飞虱致害性相关的可能基因与共生菌；通过剖析唾液分泌蛋白Nl4777在调控水稻防御反应中的作用,揭示褐飞虱致害性变异的机制。主要结果如下：1)对褐飞虱Mudgo及TN1致害性种群的脂肪体转录组进行了高通量测序。结果显示：Mudgo种群获得了32332条unigene,TN1种群获得了33775条unigene,两转录组合并后共获得42621条all-unigenes。对all-unigenes进行NR数据库功能注释发现,匹配到的物种最多的是赤拟谷盗Triboliumcastaneum。GO分类结果发现Mudgo和TN1种群分别有15461和14993条Unigene归属于描述分子功能(molecularfunction)、细胞组分(cellularcomponent)、生物学过程(biologicalprocess)这三种本体,两转录组显示出相似的GO分布模式。另外,有21142条all-unigenes得到了COG注释。14656条all-unigenes得到KEGG注释,这些all-unigenes归属于241个不同的通路。在转录组中发现了2884条微卫星SSRs,其中(CAG)n是数量最多的重复单元。两种群脂肪体转录组间共有7860个差异表达基因,它们主要与生化代谢、信号转导、免疫反应及运输等功能相关；其中,得到功能注释的基因为3858个,未得到功能注释的基因为4002个。在得到功能注释的差异表达基因中与初级代谢有关的共找到236个,涉及氨基酸代谢、脂类代谢、糖类代谢、能量代谢和异质代谢(解毒代谢)；与免疫反应有关的基因共57个,40个在Mudgo种群中表达量明显上调,主要涉及病原菌识别基因、免疫信号途径基因、AMPs基因和其它免疫相关基因；与类酵母共生菌(YLS)相关的基因317个,分属于12个属,其中德巴利氏酵母属、克鲁维酵母菌属、路德酵母属、酵母属、裂殖酵母属、Scheffersomyces、范氏酵母属和接合酵母属的YLS在褐飞虱中属首次报道；与Wolbachia相关的基因共找到了22个,20个在Mudgo种群中表达量上调。上述结果为今后研究褐飞虱不同致害性种群分化原因奠定了基础。2)根据本实验室对褐飞虱两致害性种群唾液腺转录组的比较结果,选择了在两个种群中差异表达的分泌蛋白基因Nl4777为研究对象。序列分析表明,基因Nl4777编码242个氨基酸,具有分泌信号肽,具跨膜结构,C端具有2个EF-hand结构域,含8个Ca2+结合蛋白位点,具有很强的Ca2+结合能力。系统进化研究发现该蛋白与其它生物的多重凝结因子缺陷蛋白nultiplecoagulationfactordeficiencyprotein同源。荧光定量PCR检测褐飞虱3种内参基因稳定性时发现,在不同组织中内参基因的稳定性排序为：Flightin>18SrRNA>β-Actin;不同发育时期排序为：18SrRNA>β-Actin>Flightin。据此结果对N14777mRNA在褐飞虱不同组织及不同发育期的分布模式进行检测时发现,该基因在两种群唾液腺组织中表达量均最高,在所有发育时间内表达量持续稳定。Nl4777基因在Mudgo种群唾液腺中的表达量比TN1种群唾液腺中的表达量高18.51倍,达到了极显著差异。注射Nl4777的dsRNA可有效沉默Nl4777基因,并发现基因沉默后可显著降低褐飞虱的存活率与蜜露分泌量,但对产卵量没有影响。Westernblot分析表明,分泌蛋白Nl4777在褐飞虱取食过程中可以进入水稻。通过分析水稻防御相关信号分子发现,与对照的褐飞虱取食相比,沉默靶标基因的褐飞虱突变体取食导致水稻茉莉酸(JA)含量在为害后的8h显著下降,水杨酸(SA)和过氧化氢(H202)含量分别在24h和8h显著升高。褐飞虱突变体取食也导致水稻的挥发物总量和两种单一挥发物,2-庚醇(2-heptanol)和芳樟醇(linalool),显著上升,并增强对褐飞虱天敌稻虱缨小蜂(AnagrusmilaparvataePangetWang)的引诱能力。上述结果表明,唾液分泌蛋白Nl4777通过抑制水稻的直接与间接防御反应,在褐飞虱致害性变异中发挥了重要作用。
【作者】禹海鑫；
【导师】娄永根；
【作者基本信息】浙江大学，农业昆虫与害虫防治，2013，博士
【关键词】褐飞虱；水稻；脂肪体；转录组；昆虫致害性；防御反应；唾液蛋白；

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