拟南芥和番茄对神经鞘脂类似类真菌毒素的抗性机理研究

【摘要】腐马素(fumonisin)和AAL-Toxin统称为神经鞘脂类似类真菌毒素(sphinganine-analogmycotoxins,SAMT),这类毒素通过影响植物细胞中神经鞘脂类物质的代谢促进活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的积累,进而引发细胞程序化死亡(programmedcelldeath,PCD);而且腐马素可以危害芦笋和十字花科的多种蔬菜作物,而AAL-Toxin是番茄茎枯病的致病因子,因此研究植物对SAMT的抗性机制不仅有助于完善对植物防御体系的理解,而且可以为通过化学调控和遗传工程的方法减少SAMT对蔬菜作物的危害提供理论依据和技术支撑。本研究以十字花科的模式植物拟南芥为材料,探究次生代谢物质芥子油苷和植物激素茉莉酸(jasmonicacid,JA)在植物防御SAMT诱导的PCD中的作用及其机理,解析十字花科植物特有的抗性机制。进一步以正向遗传学的思路,通过图位克隆的方法在拟南芥抗腐马素B1(fumonisinB1,FB1)突变体fbr41中,克隆到FB1抗性基因；并探究该基因的遗传转化对番茄中AAL-Toxin引起的PCD的影响,加深了人们对植物防御SAMT诱导的PCD的作用机理的理解,同时为今后通过遗传工程的途径提高番茄等作物对SMAT的抗性和番茄茎枯病的抗病育种提供了有效途径。主要的研究结果总结如下：1、为阐明次生代谢物质芥子油苷在植物对FB1诱导的PCD抗性中的作用,解析十字花科植物特有的抗性机制,以模式植物拟南芥为材料,分析了FB1胁迫时,芥子油苷生物合成相关基因的表达和芥子油苷含量的变化。结果发现,在FB1诱导植物发生PCD的过程中,色氨酸起始的次生代谢途径被激活,吲哚类芥子油苷和植物抗毒素camalexin生物合成相关基因被显著诱导,相比之下,脂肪类芥子油苷生物合成相关基因的表达被抑制。进一步对芥子油苷含量的分析发现,FB1胁迫时,吲哚类和脂肪类芥子油苷的积累都降低。突变体的研究结果显示,吲哚类芥子油苷缺失的突变体cyp79B2cyp79B3和芥子油苷水解酶黑芥子酶失活的突变体tgg1gg2,在FB1胁迫时比野生型Col-0表现更严重的PCD表型,而脂肪类芥子油苷缺失的突变体myb28myb29、camalexin缺失的突变体pad3-1和非典型降解酶PEN2失活的突变体pen2-1的PCD表型与Col-0没有明显差异。以上研究结果说明,典型性降解酶催化的吲哚类芥子油苷的代谢产物参与植物防御FB1诱导的PCD。外源完整吲哚类芥子油苷及其代谢产物的添加均显著抑制FB1引起的PCD,进一步的研究还发现,外源吲哚类芥子油苷代谢产物的添加可以抑制FB1诱导的ROS的累积,减少过氧化氢的含量,降低超氧阴离子的产生速率。以上结果表明,吲哚类芥子油苷的典型性降解通过抑制ROS的积累抑制FB1诱导的PCD。2、以JA生物合成和信号转导突变体为材料,结合JA外源处理,研究JA在FB1诱导的PCD中的作用。结果显示,JA生物合成和信号转导突变体中FB1诱导的PCD症状较野生型明显加重,说明JA参与植物对FB1诱导的PCD的防御。另外,JA相关突变体中吲哚类芥子油苷含量均显著减少；而JA外源添加急剧诱导了吲哚类芥子油苷的生物合成和水解代谢。虽然JA外源添加均可缓解野生型和吲哚类芥子油苷合成突变体cyp79B2cyp79B3中FB1引起的PCD,但是相比野生型,JA对cyp79B2cyp79B3中PCD的缓解作用显著减弱。这些结果表明,JA对FB1诱导的PCD的抑制作用很可能通过调控吲哚类芥子油苷的合成和降解来达到。3、应用正向遗传学的方法对FB1抗性突变体乃r41中的基因进行克隆,并分析其功能。遗传学分析表明,fbr41为单基因显性突变。图位克隆的结果显示,FB1抗性突变体fbr41在基因LCB2b/FBR41的内含子区发生单碱基突变,由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)。为方便区别,将突变体中LCB2b/FBR41命名为FBR41-D。分析FBR41-D的DNA序列发现,突变位点位于LCB2b/FBR41基因第一个内含子的第1位。而内含子起始的两个碱基和最后结尾的两个碱基为保守的GT-AG序列,可以被剪切体识别从而正确的剪切。因此,该位点的突变使得剪切体无法正确识别起始的剪切位点,使得剪切发生错误。cDNA测序结果表明,FBR41-D的cDNA序列在ATG开始的第126位之后插入ATTTT5个碱基。进一步的氨基酸序列分析发现,5个碱基的插入引起插入位点之后的阅读框改变,致使终止密码子提前出现,可能引起蛋白翻译的提前终止。分子互补的实验证实,FBR41-D的转化使野生型Col-0获得对FB1的抗性,证实抗FB1的表型由FBR41-D引起。FBR41-D功能的鉴定有助于我们更好地理解植物对SMAT的抗性机制,并且为通过遗传工程的手段提高蔬菜作物对SMAT的抗性提供了理论基础和技术支撑。4、AAL-Toxin诱导PCD是番茄茎枯病的发病原因,鉴于这一病害目前已成为番茄设施栽培中亟待解决的病害,为验证FBR41-D在番茄对AAL-Toxin敏感性和茎枯病防治中的功能,拟南芥中的克隆BR41-D被转入感病番茄品种Castlemart(CM)。通过转基因及抗性筛选获得35S::FBR41-D单拷贝插入的纯合番茄转基因株系,并对其进行AAL-Toxin敏感性分析。结果表明,AAL-Toxin处理使得CM叶片出现大面积的细胞坏死,而转基因植株的叶片只有少量的坏死斑。H2O2组织染色的结果也显示,AAL-Toxin诱导CM叶片积累大量的H2O2,而转基因植株中H2O2的积累被抑制。我们认为,拟南芥中的抗性基因FBR41-D的异源表达,抑制番茄感病品种CM中AAL-Toxin诱导的H2O2的积累,使CM获得对AAL-Toxin的抗性。其抗性机制可能依赖于FBR41-D对番茄神经鞘脂类生物合成途径中第一个限速酶丝氨酸-棕榈酰转移酶(serinepalmitoyltransferase,SPT)活性的抑制。以上结论说明FBR41-D对SAMT具有普遍抗性,而且番茄中SPT酶的活性直接影响其对AAL-Toxin的敏感性,这些结果为番茄茎枯病的抗病机制的揭示和抗病分子育种的实践提供了理论依据。
【作者】赵彦婷；
【导师】汪俏梅；
【作者基本信息】浙江大学，蔬菜学，2014，博士
【关键词】神经鞘脂类似类真菌毒素；腐马素B1；芥子油苷；茉莉酸；图位克隆；丝氨酸-棕榈酰转移酶；AAL-Toxin；番茄转基因；

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