柑橘绿霉病菌鞘脂质代谢途径相关基因功能研究

【摘要】鞘脂质不仅是细胞质膜的重要组份,构成脂筏参与物质的运输,而且代谢途径的一些中间产物还是信号分子,调控细胞增殖、离子平衡和外界刺激的应答等生命活动,最近的研究发现鞘脂质还参与了病原真菌的致病过程。尽管鞘脂质普遍存在于动物、植物和真菌中,但真菌鞘脂质的分子结构和合成途径与植物和动物显著不同,其合成途径中的关键酶可能是新型杀菌剂的理想靶标。因此,明确植物病原真菌的鞘脂质代谢过程及其调控,以及参与该途径关键酶基因的功能和酶的结构对新型杀菌剂的开发具有理论和现实意义。由指状青霉菌(Penicilliumdigitatum)引起的柑橘绿霉病是采后柑橘的最主要病害,其为害造成的损失通常占采后柑橘总损失的90%。本文以柑橘绿霉病菌为材料,根据已知的基因组序列,预测其鞘脂质合成途径,建立了柑橘绿霉病菌主要鞘脂质种类的HPLC-MS/MS测定方法,通过构建基因敲除和互补突变体,研究了鞘脂质合成途径中PdMitl(mannoseinositolphosphorylceramidetransferase)和PdGcsl(GlcCersynthase)基因在生长、产孢、离子胁迫和致病过程中的作用。主要的研究结果如下：1柑橘绿霉病菌与酿酒酵母的鞘脂质合成途径不尽相同以参与酿酒酵母鞘脂质合成途径的基因为参考,在柑橘绿霉病菌基因组数据库中进行同源性搜索发现,与烟曲霉(Aspergillusfunigatus)相似,柑橘绿霉病菌基因组中含有模式生物酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)鞘脂质合成途径所需要的大部分基因的同源序列,但是也存在一些差异。首先,柑橘绿霉病菌基因组中不存在酿酒酵母Tsc3的同源序列,推测Lcbl和Lcb2同源序列EKV07450和EKV05826分别编码柑橘绿霉病菌丝氨酸-软脂酰辅酶A转移酶的两个亚基,参与柑橘绿霉病菌鞘脂质合成途径的第一步反应。其次,柑橘绿霉病菌基因组中没有编码肌醇磷脂酰转移酶Ipt1的同源序列,生成的甘露糖-肌醇磷脂酰-神经酰胺不能被进一步催化成甘露糖-(肌醇磷脂酰)：-神经酰胺。因此,甘露糖-肌醇磷脂酰-神经酰胺可能是柑橘绿霉病菌鞘脂质合成途径的终产物。再次,合成葡糖基神经酰胺所需的所有基因在柑橘绿霉病菌基因组中都有同源序列,而酿酒酵母鞘脂质代谢途径中没有葡糖基神经酰胺的合成。2鞘脂质参与柑橘绿霉病菌菌丝的极性生长鞘脂质合成途径抑制剂多球壳菌素(myriocin)、腐马霉素B1(fumonisinB1,FB1)和短梗霉素A(aureobasidinA,AbA)对柑橘绿霉病菌生长的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.8μg/ml,0.8μg/ml和0.4μg/ml.在半MIC浓度下,分生孢子萌发的芽管表现扭曲和提前分枝,表明鞘脂质对柑橘绿霉病菌菌丝生长极为重要,参与其极性生长。3初步建立了液相色谱质谱联用检测柑橘绿霉病菌菌丝鞘脂质种类的方法在正电离子模式下,利用电喷雾质谱,通过多反应监测扫描母离子和子离子,参考标准品的色谱保留时间,质谱分析结果,初步实现了柑橘绿霉病菌菌丝中主要鞘脂质种类的色谱分离和质谱定性。利用该方法发现柑橘绿霉病菌的鞘氨醇为d18：1、植物鞘氨醇为t18：0、葡糖基神经酰胺为d18：2/18：0h和d18：1/18：0h。它们的母离子峰[M+H+]+分别是300、318、742和744。4PdMit1参与柑橘绿霉病菌菌丝生长、产孢、孢子萌发、对二价离子和两性霉素敏感甘露糖-肌醇磷脂酰-神经酰胺等复杂鞘脂质与甾醇等脂类共同组成了脂筏,参与物质运输和细胞内吞。序列比对分析发现柑橘绿霉病菌基因组含有编码烟曲霉肌醇磷酸神经酰胺甘露糖转移酶基因的同源序列PdMit1。利用农杆菌介导的同源重组技术构建了PdMit1缺失和回补突变体。与野生型菌株相比,ΔPdMit1突变体的菌落大小、产孢量和孢子萌发率均明显降低,而回补突变体CPPdMit1的表型与野生型菌株一致,表明PdMit1参与了柑橘绿霉病菌的菌丝生长、产孢和孢子萌发。ΔPdMit1突变体中的麦角甾醇含量比野生型菌株高,对两性霉素的敏感性增加。实验还发现,在高浓度的Ca2+条件下,ΔPdMit1突变体的液泡融合受阻,对高浓度的Ca2+和Mg2+更加敏感。表达分析发现在高浓度Ca2+胁迫下,参与液泡离子运输的三个Ca2+-ATPase基因PMC1、PMR1和PMCA的相对表达量在野生型菌株中明显上升,而在1PdMit1中没有明显变化,表明PdMit1基因可能直接或间接参与的Ca2+-ATPase基因的表达调控,参与决定对Ca2+的敏感性。5PdGcsl编码葡糖基神经酰胺合成酶,参与柑橘绿霉病菌菌丝生长、产孢和孢子萌发葡糖基神经酰胺合成酶是真菌葡糖基神经酰胺合成途径中的关键酶。序列比对分析发现,柑橘绿霉病菌基因组中含有白色念珠菌(Canidiaalbicans)和隐球酵母(Cryptococcusneoformans)Gcs1的同源基因PdGcs1。PdGcs1含有两个核苷酸识别区域NRD2L和NRD2S,以及葡糖基神经酰胺合成酶活性位点D1、D2、D3和Q/RXXRW基序。△PdGcs1突变体缺少GlcCer(d18:2/18:0h)和GlcCer(d18：1/18：0h)。说明PdGcs1编码了葡糖基神经酰胺合成酶,并参与柑橘绿霉病菌GlcCer的合成。与野生型菌株相比,△PdGcs1突变体的菌落生长变慢,产孢量下降了32%,孢子萌发率降低了44.7%；与野生型菌株相比,△PdGcs1突变体在柑橘果实上的侵染速度减慢,致病性下降一半以上。这些结果表明PdGcs1参与了柑橘绿霉病菌的菌丝生长、产孢和孢子萌发,以及致病性。葡糖基神经酰胺是目前为止所知的第一个参与柑橘绿霉病菌毒力的小分子。
【作者】朱从一；
【导师】李红叶；
【作者基本信息】浙江大学，植物病理学，2014，博士
【关键词】柑橘绿霉病菌；鞘脂质生物合成途径；液相色谱质谱联用；肌醇磷脂酰神经酰胺甘露糖转移酶基因Mitl；葡糖基神经酰胺合成酶基因Gcsl；葡糖基神经酰胺GlcCer；生长；产孢；致病性；

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