拟南芥AGO4/siRNA复合体细胞质内组装和不依赖DCL的小RNA介导DNA甲基化的机理研究

【摘要】DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰。在植物中,DNA甲基化可以通过RNA介导的DNA甲基化(RNAdirectedDNAmethylation,RdDM)通路所建立。在RdDM通路中,主要来源于基因组重复区域的hc-siRNA(heterochromaticsmallinterfereingRNA)与ARGONAUTE4(AGO4)蛋白结合组成复合体并进一步招募DNA甲基转移酶DRM2(DomainRearrangedMethyltransferase2),介导与hc-siRNA互补DNA的甲基化修饰。由于hc-siRNA的产生和最终行使功能都在细胞核中进行,RdDM通路一直被认为是一个完全发生在细胞核中的过程。本研究通过对拟南芥细胞质和细胞核中的小RNA(smallRNA,sRNA)组分进行系统分析,意外地发现,hc-siRNA大部分以游离的双链形式存在于细胞质中。进一步的细胞和生化实验证明：在细胞质内,AG04在HSP90蛋白的帮助下结合双链siRNA,然后通过其核酸内切酶活性切割并降解其中一条链,形成成熟的AGO4/siRNA效应复合体。siRNA的结合很可能导致AG04构象发生变化,暴露出其核定位信号,细胞因此可以选择性地识别并转运成熟的AGO4/siRNA复合体至细胞核内。该研究揭示了RdDM通路中AGO4/siRNA效应复合体在细胞质内组装的重要步骤,修正了人们以前认为RdDM通路完全在细胞核内进行的观点。细胞选择性地转运成熟的AGO4/siRNA复合体进入细胞核,很可能是RdDM通路进入效应阶段之前的一个关键调控点。真核生物中存在多种多样的sRNA生成方式,其中最主要方式的是通过RNA酶Ⅲ(RNaseⅢ)家族的Dicer蛋白切割双链RNA而产生,除此之外目前还发现了多种不依赖Dicer的sRNA。拟南芥中已知的sRNA都需经Dicer类似蛋白(Dicer-like,DCL)加工产生。本研究通过分析拟南芥dcl突变体中的sRNA,鉴定了一类不依赖DCL的sRNA(DCL-independentsRNA,DI-sRNA)。与DCL加工的21-24nucleotide(nt)sRNA相比,这些DI-sRNA有更广泛的长度分布,主要集中于20-60nt。大部分DI-sRNA来源于已知的包括转座子和其它重复序列的RdDM靶位点,并倾向于从进化上较“年轻”的转座子产生。进一步实验表明,DI-sRNA可与AG04的结合,并将其招募到DI-sRNA的同源序列,介导DNA甲基化。有意思的是,部分DI-sRNA呈现出5’端序列相同而3’端不同的阶梯状分布；因此,我们推测DI-sRNA可能是通过前体先被AG04结合,然后进行3’-5’修剪的方式产生。本研究表明拟南芥可产生一类不依赖于Dicer的DI-sRNA,这些DI-sRNA可能是建立RdDM的初始信号。
【作者】叶瑞强；
【导师】周雪平；戚益军；
【作者基本信息】浙江大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】小RNA；DNA甲基化；Dicer；Argonaute；RISC组装；核转运；

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