耐辐射奇球菌转录组测序数据发掘及抗性相关基因功能研究

【摘要】耐辐射奇球菌以对电离辐射以及氧化等逆境胁迫的抗性而著称。这些逆境胁迫都不同程度地对维持生命的大分子DNA、蛋白质,以及膜结构造成损伤。耐辐射奇球菌的抗性机制一直是研究的热点,早期的基因芯片等技术从全局水平上对转录调控模式的研究表明,耐辐射奇球菌超强的DNA损伤修复系统以及强大的ROS清除系统在应对逆境胁迫中发挥重要的作用。芯片技术具有依赖于序列注释以及动态范围等局限性,为了从全局转录水平上发掘更多的信息,以便更好地去理解耐辐射奇球菌的抗性机制,我们采用SOLiDTM平台对耐辐射奇球菌的野生型及过氧化氢处理样本进行了深度测序。我们从深度测序数据中获得了全转录组水平的基因差异表达谱,并对代谢途径做了分析。同时,我们还发现了一些未被报道过的基因在ROS肋迫下显著改变其转录水平。全转录组的信息还能用于小RNA(或者称为调控性RNA),包括mRNA的前导调控性序列,以及非编码小RNA等的搜索。小RNA在原核生物的转录调控中的作用越来越受重视,但是已报道的这类RNA并不多。在耐辐射奇球菌中,这方面研究还很少。Rfam数据库上关于耐辐射奇球菌的ncRNAs主释,除了tRNA外,只有少数几个预测的如FMN,T-box,Y-RNA等。我们也对耐辐射奇球菌的小RNA进行了全局的发掘,为后续对小RNA功能研究提供参考。耐辐射球菌的基因组测序完成较早,受制于当时技术,还存在一些错误。我们就在数据库注释以外的地方发现了一些新的开放性阅读框,这些开放阅读框的“丢失”可能是由于早期的测序数据中存在遗漏或错误。RNA测序一定程度上能发现这些错误,并通过BLASTP同源搜索,以及种属内基因相对定位辅助证明这些位置的保守性。我们对其中发现的一个“丢失的”Fur家族的同源物DrPerR进行了实验验证。通过重新测序排除了原基因组由于一个碱基缺失导致的移码突变,并获得该基因的正确序列。我们在后续对该基因的研究中发现,该基因的缺失导致了耐辐射奇球菌对过氧化氢更强的抗性,细胞抽提物分析显示,其总抗氧化活性和过氧化氢酶活性都显著的提升了。随后的qRT-PCR和EMSA实验进一步发现DrPerR在通常状态下能够抑制过氧化氢酶的表达,而对Dps-1(dr2263编码)的抑制,显示出其参与了在细胞内金属离子的调控,这些结果表明DrPerR行使了PerR-like的功能。这些研究增进了对耐辐射奇球菌应对ROS胁迫复杂调控网络的认识。我们的研究展示了深度测序数据的重要性,并提供了一些深度测序数据在实际应用中的思路。
【作者】刘程智；
【导师】华跃进；
【作者基本信息】浙江大学，生物物理学，2014，博士
【关键词】耐辐射奇球菌；深度测序；氧化胁迫；非编码RNA；PerR；

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