桃过敏原蛋白nsLTP的基因多样性和双单抗夹心ELISA测定方法

【摘要】植物非特异性脂质转移蛋白(Non-specificLipidTransferProtein,nsLTPs)是广泛存在于植物体内的一类碱性可溶性蛋白,约占植物体总蛋白的4%,分子量相对较小,存在于植物体的多个器官(胚、子叶、茎、叶、果实以及花器官)中,而围绕植物器官的皮细胞和外周细胞、器官脱落区的nsLTPs含量最高。植物nsLTPs参与多个生物学过程,如细胞膜的形成、脂质的定向转运、角质层的形成、胚胎形成、抗病、共生和适应不良环境等。植物nsLTPs是一种泛过敏原,导致多种水果和花粉过敏,由于其蛋白家族高度保守的氨基酸组成和结构,植物nsLTPs是导致不同水果之间以及水果和花粉之间交叉过敏的主要原因,如苹果和桃,桃和蒿属花粉等。桃(Prunuspersica(L.)Batsch)起源于中国西部地区,我国的桃种资资源丰富,种植面积和产量均居世界首位。桃是一类常见的水果致敏源,可引起较为严重的过敏反应。在欧洲南部和中国北方地区,非特异性脂质转移蛋白是桃过敏的主要过敏原。已有研究初步证明不同桃品种nsLTP的转录和表达存在差异。本研究分析了不同桃品种及桃近缘野生种nsLTPs基因多样性和nsLTPs蛋白差异表达的原因,同时还调查了桃及桃近缘野生种的nsLTPs基因上游区段的核苷酸差异；利用桃重组蛋白rPrup3免疫小鼠,制备得到7个抗桃nsLTP单克隆抗体,经过鉴定和免疫活性测定,对其中的一个单抗(4-1)进行生物素标记,并以其作为检测抗体,筛选出另一个单抗(B10-5)作为包板抗体,建立双单抗夹心ELISA法,用以检测桃果实中的Prup3含量；用建立的双单抗夹心ELISA法测定了8个桃品种果皮和果肉中Prup3的含量。主要研究结果如下：1.普通桃品种中nsLTPs基因非常保守,分析比对了47个普通桃品种的Prup3编码核苷酸序列,未发现任何变异位点,普通桃的nsLTPs蛋白无序列差异。普通桃品种与三个桃近缘野生种(甘肃桃、山桃和光核桃)的nsLTPs基因存在较大差异,共发现18处变异位点,包括16处点突变和2处缺失,其中有10处变异是在基因的第一个外显子区域,另外8处在内含子区域,第二个外显子完全保守。根据这个基因的核苷酸变异位点数量,山桃与普通桃之间的差异比较大,山桃与普通桃之间的变异位点有12个,而光核桃和甘肃桃分别是5和4个。在氨基酸水平上,山桃与普通桃之间存在7个变异,包括位于信号肽区段的1个；甘肃桃与普通桃有两个氨基酸差异,光核桃与普通桃仅有一个。分析蔷薇科不同水果nsLTPs的进化关系,普通桃、甘肃桃和光核桃聚在一组,而山桃与扁桃聚在一起,属于另一个组。2.分析桃和桃近缘野生种nsLTPs启动子,得到三种单倍型upLTP1-a、upLTP1-b和upLTP1-c,三条序列之间存在24处单核苷酸变异位点,其中包括20处转换,2处颠换和2处缺失。27个被测普通桃品种中,有13个品种含有upLTP1-c,9个品种含有upLTP1-a,而只有6个品种含有upLTP1-b,这6个品种均是杂合状态,同时含有upLTP1-b和upLTP1-c,都来自于中国北方地区。在不同桃亚群中等位基因upLTPl-a、upLTP1-b和upLTP1-c的基因频率不同。在“玉露”桃亚群中,upLTP1-a的基因频率最高；而在“白凤”亚群中,占主导地位的是upLTP1-c;在古老地方品种中,upLTP1-b和upLTP1-c的基因频率比较接近,都较高；而在“白凤”亚群中,等位基因upLTP1-b的基因频率只有0.086。三个桃近缘野生种光核桃、甘肃桃和山桃只含有等位基因upLTPl-b,与来源于北方的地方老品种同源性较高。对启动子区域进行生物信息学分析,发现多个转录表达调控元件如TATA-box和CAATbox,以及光响应元件(AC-Ⅰ,AE-box,G-box,GT1-motif,GAG-motif,SP-1,CG-motif和Ⅰ-box等),与植物非生物胁迫相关的响应元件(OBP-1site,AT-richsequence,TATC-box,MBS等)。3.以高纯度的重组蛋白rPrup3免疫BALB/c小鼠,经过筛选获得7株能够稳定分泌抗rPrup3的杂交瘤细胞株：4-1,4-6,A7-1,A7-2,6-F7,11-B7和B10-5,经效价测定分析,这7株单克隆抗体的效价分别是1：20000,1：10000,1：60000,1：20000,1：20000,1：20000和1：20000。经过类型及亚型分析,7株单克隆抗体均属于IgG类,4-1和4-6是IgG2a(kchain),其余5个是IgG1(kchain)。以重组蛋白rPrup3为抗原,以制备的单克隆抗体为一抗,通过Westernblotting鉴定单克隆抗体的抗体反应性,结果表明这7株单克隆抗体均能有效地识别桃nsLTP。4.经过特异性结合活性检测和组合筛选,最终确定一对单克隆抗体(4-1和B10-5),其中4-1(经生物素化标记)作为检测抗体,B10-5用作包板抗体建立双单克隆抗体夹心ELISA检测体系。测定结果表明该检测方法具有较高精确度和准确度,重复性和稳定性都较好。特异性检测结果显示,抗体组合4-1和B10-5能够与桃nsLTP进行特异性结合,与其他核果类如杏、李和樱桃等nsLTP也能够进行特异性结合,但结合活性远远低于与桃nsLTP的结合。5.用已知浓度的纯化Prup3蛋白作标准品,利用已建立的双单抗夹心ELISA方法测定8个桃品种果皮和果肉中Prup3含量,结果表明同一品种中,果皮中Prup3的含量远远高于果肉中。不同品种之间Prup3的含量存在较大差异,果皮中含量较高的品种是“红珊瑚”,高达9.05μg/g,含量最低的品种是“艳凤”,含量是1.55μg/g。8个品种中果皮Prup3的平均含量是6.6μg/g。果肉中Prup3的含量普遍较低,含量在0.07-0.77μg/g之间。果肉中Prup3含量最高的是“秋分桃”和“锦绣黄桃”,与果皮中不太一致。
【作者】马英桃；
【导师】高中山；
【作者基本信息】浙江大学，果树学，2014，博士
【关键词】桃；非特异性脂质转移蛋白；遗传多样性；过敏原；酶联免疫吸附试验；单克隆抗体；纯化蛋白；

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