白菜花粉壁发育相关的四个多糖代谢基因的表达分析与功能鉴定

【摘要】花粉壁不仅在花粉发育和受精过程中发挥重要作用,还和雄配子存活、雄性不育以及花粉识别等过程相关。自四分体形成之后,由小孢子和绒粘层控制的花粉壁的形成成了花粉发育中的主要事件。这一过程涉及一系列花粉壁合成生物分子的参与,受高度复杂的基因网络调控。深入认识花粉壁发育相关基因的功能及关键基因间的调控关系,将为充分理解植物有性生殖的分子机制,并利用其有效地调控育性,实现农作物高产、高效繁殖等提供理论依据和技术支持。本文以白菜(BrassicacampestrisL.ssp.chinensisMakino,syn.B.rapassp.chinensis)‘矮脚黄’核雄性不育(’Aijiaohuang’genicmalesterility,ajhGMS)两用系ajhGMS’Bcajh97-01A/B’为材料,对两个经典阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactanproteins,AGPs)基因BrassicacampestrisMaleFertility8(BcMF8)和BrassicacampestrisMaleFertility18(BcMF18)与两个果胶甲酯酶(pectinmethylesterases,PMEs)基因BrassicacampestrisMaleFertility23a(BcMF23a)和BrassicacampestrisMaleFertility23b(BcMF23b)进行序列结构和表达分析,并采用反义RNA技术对BcMF8和BcMF18进行单基因抑制和双基因共抑制进行功能验证,继而采用形态学、分子生物学和细胞学的方法,研究它们在白菜花粉发育和花粉管生长过程中的作用机制。同时,利用过表达基因转化拟南芥(Arabidopsisthaliana),研究外源AGP基因BcMF18对花粉壁发育的影响。取得的主要结果与结论如下：(1)通过基因表达和功能分析,发现经典AGP基因BcMF8与花粉内壁发育、萌发沟形成和花粉管生长相关。对本实验室前期分离得到的在花发育后期小孢子中表达的BcMF8进行Real-timeRT-PCR和组织原位杂交分析,发现BcMF8除在花粉中表达外,还是一个授粉后持续表达基因,在花粉管和授粉后柱头表面表达。原核表达分析结果显示BcMF8编码一个大小约为20kDa的水溶性蛋白。亚细胞定位结果显示BcMF8分布于细胞壁、质膜和胞外基质。采用反义RNA技术抑制BcMF8的表达,发现转反义BcMF8基因菜心植株结籽率降低,花粉形态异常、呈“拖鞋状”两侧向内坍塌,萌发沟分布异常,内壁在单核花粉晚期于正常的三个萌发沟区域外增厚,成熟花粉中萌发沟数目增加到四个；部分花粉不能正常萌发,且萌发的花粉管绝大多数不能正常生长；体内花粉管的萌发和生长受阻,但仅限于早期在花柱中生长,后期仍有部分花粉管顺利到达子房基部并完成双受精,但结籽率明显降低。这些结果都表明BcMF8参与花粉内壁形成和花粉管生长,在维持花粉壁和花粉管基质结构方面发挥着重要作用。(2)基因表达和功能分析结果表明BcMF18是一个与花粉内壁发育相关的经典AGP基因。采用同源克隆的方法,获得了AGP基因BcMF18的cDNA和DNA全长。核酸序列和推演的氨基酸序列分析结果表明其具有经典AGP基因的特征。通过半定量、Real-timeRT-PCR和组织原位杂交分析,发现BcMF18的转录本最早在单核花粉期开始出现,随后在双核花粉期、成熟花粉期的花蕾及开放的花中持续表达,并仅限于花粉中检测到,表明BcMF18可以归为花粉发育“晚期”基因。原核表达分析结果显示BcMF18编码一个大小约为20kDa的水溶性蛋白。亚细胞定位结果显示BcMF18分布于细胞壁、质膜和胞外基质。过表达基因转化拟南芥植株角果短、结籽率降低,近50%的花粉皱缩、体积变小、不能正常萌发出花粉管,畸形花粉自双核时期出现异常,内壁建成后发生降解、纤维素不能正常沉积,进一步引发细胞核和内含物降解,只剩下含油层、外壁外层和外壁内层。采用反义RNA技术抑制BcMF18的表达,发现转反义植株角果变短、结籽率降低,近50%的花粉皱缩、体积变小、不能正常萌发出花粉管,畸形花粉自单核发育时期即开始出现异常,双核期的花粉不能正常形成内壁和沉积纤维素,且内含物和细胞核发生降解,最终形成的花粉只是外壁和含油层构成的空壳,不具细胞核和正常生活力。这些结果都表明,BcMF18可能通过影响纤维素沉积而影响花粉内壁发育。(3)通过基因表达和功能分析,发现BcMF8和BcMF18表达模式相似但不完全相同,在花粉发育过程中功能不重叠,在绒粘层程序性细胞死亡过程(programmedcelldeath,PCD)中功能冗余。BcMF8和BcMF18核苷酸序列相似性为52.3%,在氨基酸序列相似性为65.2%。Real-timeRT-PCR分析结果表明BcMF8和BcMF18均具有花粉发育后期花粉特异表达的特征,在不同发育阶段的组织或器官中的表达变化趋势大体相近,都在单核花粉期左右的花蕾中开始有微弱表达,随着花发育的进行,表达量逐渐升高,但不完全相同。在同一组织或器官中,BcMF8的表达量要比BcMF18高,且只有BcMF8为授粉后持续表达基因。采用反义RNA技术同时抑制BcMF8和BcMF18的表达后,花粉畸形率比单个基因抑制后的高,但花粉缺陷并没有加剧,花粉综合呈现了两种分离表型：“拖鞋状”两侧向内坍塌的花粉,其内壁在预定的三个萌发沟区域外增厚,萌发沟数目增加；皱缩表型的花粉,纤维素不能沉积,内壁不能正常形成,花粉内含物和细胞核降解。单独抑制BcMF8或BcMF18的表达后,绒粘层发育异常,但两者同时受到抑制后,绒粘层却提前发生了降解,表明BcMF8和BcMF18在绒粘层PCD过程中发挥作用,且功能冗余。(4)通过基因表达分析,发现两个PME基因BcMF23a和BcMF23b均在花发育晚期花粉中表达,编码两个定位于质膜和细胞壁的分泌蛋白。采用同源克隆的方法,获得了拟南芥PME基因At5g07410在白菜中两个同源基因BcMF23a和BcMF23b的cDNA和DNA全长。核酸序列和推演的氨基酸序列分析表明两者均具有经典PME基因的特征,两者核苷酸序列相似性为86%,氨基酸序列相似性为89.3%。半定量、Real-timeRT-PCR、组织原位杂交分析和启动子活性表达分析结果表明BcMF23a和BcMF23b在双核花粉时期开始于花粉中表达直至成熟花粉时期,开放花中检测不到表达,并仅限于花粉中；除花粉外,BcMF23b还在瓣膜基部、幼苗真叶基部离层及主侧根中的表达。原核表达分析结果显示BcMF23a和BcMF23b编码两个大小约为40kDa的水溶性蛋白。酶活检测发现在大肠杆菌(Escherichiacoli)表达体系中诱导表达的BcMF23a具有PME活性,而BcMF23b检测不到PME活性。亚细胞定位结果显示BcMF23a和BcMF23b分布于细胞壁、质膜和胞外基质。
【作者】林苏娥；
【导师】曹家树；
【作者基本信息】浙江大学，蔬菜学，2014，博士
【关键词】白菜；Brassicacampestrisssp.chinensis；Brassicarapassp.chinensis；Chinesecabbage-pak-choi；花粉发育；花粉壁发育；花粉管生长；内壁；基因表达；基因结构；阿拉伯半乳糖蛋白；AGPs；果胶甲酯酶；PMEs；BcMF8；BcMF18；BcMF23a；BcMF23b；

【参考文献】
[1]郭艳群.移动网室内分布系统原理及运用[D].南京邮电大学,电子与通信工程（专业学位）,2012,硕士.
[2]易国勇.消灭时效制度研究[D].华东政法学院,法律,2003,硕士.
[3]杨春华.数据挖掘、OLAP在财务决策中的应用[J].财会通讯,2002,10:39-40.
[4]郭素琴.河北省G县农村空巢家庭养老现状及社会工作介入[D].内蒙古师范大学,社会工作（专业学位）,2013,硕士.
[5]蔡凌飞.高中物理“微课程”的设计与实现研究[D].苏州大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[6]赵杰煜,张泉方,汪加才.一种新型随机二进制神经网络[J].自动化学报,2002,05:736-744.
[7]刘爽,陈伟,彭轼,陈鑫,李俊峰.DATAGUARD数据容灾策略[J].石油地球物理勘探,2008,S1:172-175+196.
[8]刘学.电增强分子印迹固相微萃取技术及其应用[D].大连理工大学,2012.
[9]王兆红.基于梯形云的数量型关联规则挖掘方法[J].信息技术与信息化,2005,06:98-100.
[10]王彤.戒日王戏剧研究[D].中国艺术研究院,戏剧戏曲学,2013,硕士.
[11]刘琳,赵军,付金霞,王雪平.我国航空航天遥感技术进展初探[J].华北航天工业学院学报,2005,03:10-13.
[12]周伟.耐高温炭基吸波剂的调控、结构及性能研究[D].中南大学,材料科学与工程,2014,博士.
[13]段新民.矿井提升绕线式异步电动机串电阻起动过程计算[J].电气工程应用.1987(04)
[14]陈福锋,钱国明,魏曜.基于故障点位置识别的串补线路距离保护方案[J].电力系统自动化,2009,21:66-71.
[15]林艺娜.广东省农村群体性突发事件应急管理研究[D].兰州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[16]张丽娟.PLA_2、PAF在大鼠羊水栓塞发病机制中的实验研究[D].遵义医学院,病理学与病理生理学,2014,硕士.
[17]何兵红,吴国忱,郭念民.基于叠前地震道集的FVO分析方法[J].石油地球物理勘探,2013,01:94-102+8-9.
[18]齐山德.试析19世纪末—20世纪初俄国的“新自由主义”[D].吉林大学,世界史,2004,硕士.
[19]张侠.光伏发电自消费商业模式及其激励政策研究[D].中国矿业大学,企业管理,2014,硕士.
[20]刘兰锋,曹思远,李绪宣,王鲁,姜绍辉,陈宝书,汪小将.未固结含气砂岩储层低频地震响应特征研究[J].石油地球物理勘探,2010,06:873-878+936+788-789.
[21]漆晓勤.《四库全书》经部文献中的伏羲史料考辨[D].西北师范大学,中国古典文献学,2014,硕士.
[22]杨成湘.我国劳资关系集体协商制度实施、评价及创新研究[D].中南大学,工商管理,2013,博士.
[23]毛威.热对流条件下悬浮颗粒运动的格子Boltzmann方法模拟[D].华中科技大学,热能工程,2013,硕士.
[24]刘雅庆.Comparative Analysis of Cohesive Devices in English and Chinese Versions of Hong Gao Liang Jia Zu[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[25]许国齐,段红彬,王媛媛.客户关系管理(CRM)在证券公司的应用[J].价值工程,2002,04:52-55.
[26]诸敏.银杏黄酮的体外Ⅱ相代谢及其药物相互作用[D].浙江大学,2004.
[27]柯文德,彭志平,蔡则苏,朴松昊,陈珂.仿人机器人相似性运动轨迹跟踪控制研究[J].自动化学报,2014,11:2404-2413.
[28]程佳铭.教师备课与学生学业成就以及教学实践、教师学习的关系[D].华东师范大学,学习科学与技术设计,2013,硕士.
[29]侯佛钢.我国中小学教师参与教育政策制定的路径研究[D].西南大学,教育经济与管理,2014,硕士.
[30]骆卫峰.一个水稻隐性矮秆突变体的遗传分析和基因精细定位[D].南京农业大学,作物遗传育种,2012,硕士.
[31]宋可莹.聚酰亚胺纳滤膜制备与性能研究[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[32]唐加福,汪定伟,高振,王瑾.面向非线性规划问题的混合式遗传算法[J].自动化学报,2000,03:401-404.
[33]刘长文.基于粘性涡粒子方法的直升机地面效应模拟分析[D].南京航空航天大学,飞行器设计,2012,硕士.
[34]宋占勋.焊接结构疲劳强度研究及其应用[D].北京交通大学,2012.
[35]李楠.容城方言民俗词语研究[D].西南大学,汉语言文字学,2014,硕士.
[36]邹丽芸.绘画疗法对大学生自我意识提升的应用研究[D].山东艺术学院,艺术学,2012,硕士.
[37]孙海燕.从《中国时报》广告审视台湾社会消费文化的变迁-1988到2012年[D].华南理工大学,传播学,2014,硕士.
[38]韦小凤.电子封装用AuSn20共晶焊料的制备及其相关基础研究[D].中南大学,材料科学与工程,2014,博士.
[39]李亚男,顾觉奋.多柔比星纳米载药系统逆转肿瘤多药耐药的研究进展[J].抗感染药学,2014,03:177-182.
[40]严格.云计算在区域医疗信息化中的应用研究[D].北京交通大学,2011.
[41]陈大雄.光纤Bragg光栅加速度传感器动态特性的研究[D].武汉理工大学,机械电子工程,2004,硕士.
[42]彭姗姗.论《白色城堡》中的叙事艺术[D].华中师范大学,比较文学与世界文学,2013,硕士.
[43]陈美娜.基于WEB使用挖掘的智能个性化系统研究[D].河北工业大学,2004.
[44]刘梅琴.永定客家土楼围合形态的环境适应性衍变研究[D].华侨大学,建筑学,2014,硕士.
[45]王晓凯.城市轨道交通供电直流侧短路故障定位的研究[D].北京交通大学,2014.
[46]朱万旭,郑晓龙.HVM-P型锚板强度分析[J].海威姆预应力技术.2001(06)
[47]徐薇.高校公共艺术教育管理转型研究[D].宁波大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[48]李贺.信息化时代人的异化问题研究[D].贵州师范大学,马克思主义哲学,2014,硕士.
[49]许韦伟.喀左县乡镇政府绩效评估研究[D].东北大学,行政管理,2010,硕士.
[50]王磊.基于界面化学的二维纳米材料体系设计及其电化学性能研究[D].西北大学,材料化学,2014,博士.