稻瘟病菌SNF1途径和细胞自噬蛋白MoAtg14的功能分析

【摘要】稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)是引起水稻病害稻瘟病的病原真菌,严重威胁着世界水稻产量和粮食安全。目前它及其宿主水稻的基因组测序均已完成,同时结合不断涌现的新技术使稻瘟病菌-水稻互作系统成为病原菌-宿主植物互作机制研究的模式系统。稻瘟病菌具有典型的侵染循环,从分生孢子萌发到侵染菌丝形成整个初级侵染阶段都处在没有外界营养的环境中,因此维持细胞能量稳态十分关键。SNF1途径和细胞自噬过程在真核生物中高度保守,是维持体内能量动态平衡所必需的。本研究以稻瘟病菌SNF1复合体及其上游激酶,以及一个新的细胞自噬蛋白MoAtg14为研究对象,通过基因敲除、荧光标记、表型分析和侵染结构观察等手段系统地分析了SNF1途径及MoAtg14在稻瘟病菌病害循环中的作用,并结合酵母双杂交和Westernblot等分子生物学方法初步探讨了SNF1途径网络关系和PI3K复合体组成,获得的主要研究成果如下1)在稻瘟病菌中SNF1途径通过参与过氧化物酶体维持及脂质代谢而行使能量传感器的功能通过监测过氧化物酶体定位信号GFP-PTS1,发现△Mosnf1等突变体菌丝中倾向于形成增大的过氧化物酶体,而且分生孢子和附着胞中过氧化物酶体的数量显著下降,这说明SNF1途径与过氧化物酶体维持有关。同时,SNF1途径突变体的脂质、脂肪酸等非发酵型碳源利用受阻,而且在附着胞形成过程中脂滴转运和降解严重延迟,这可能足突变体中过氧化物酶体功能不足造成的。2)SNF1途径是稻瘟病菌附着胞形态建构、膨压积累及致病性所必需的SNF1途径的中断导致分生孢子中主要储存物脂滴的转运和降解受阻,一方面使附着胞分化及侵染菌丝形成所需的能量和底物来源不足,另一方面使形成膨压所必需的甘油积累受到影响。所造成的综合后果是附着胞直径变小、细胞壁孔隙增大以及膨压下降,最终导致附着胞功能受损及侵染菌丝扩展受阻。3)外源葡萄糖可以部分恢复SNF1途径各突变体的表型葡萄糖代谢可以绕过过氧化物酶体的功能而直接为附着胞形态建构提供所需的能量和物质。当在分生孢子悬浮液中添加葡萄糖时,SNF1途径各突变体的附着胞大小和细胞壁孔隙趋于正常,能够形成扩展的侵染菌丝,致病性部分恢复。4)SNF1复合体的完整性及其上游激酶对稻瘟病菌生长发育至关重要除了之前鉴定的催化亚基MoSnfl外,本研究通过同源比对、结构域预测和酵母双杂交,确定了稻瘟病菌SNF1复合体的p亚基MoSip2和γ亚基MoSnf4。△Mosip2和△Mosnf4的表型与△Mosnf1相似,包括气生菌丝稀疏、产孢能力下降、孢子形态异常、附着胞形成率降低和侵染力严重受损等。这说明完整的SNF1复合体是稻瘟病菌形态发育正常进行所必需的。我们还得到SNF1上游激酶的无义突变体△Mosak1和△Motos3,及其双敲突变体△Mosak1△Motos3,并对它们进行了系统分析。结果表明△Mosak1△Motos3的大部分表型与△Mosnf1类似,且在划伤的寄主组织表面也不能致病,说明SNF1复合体上游激酶对SNF1的活性及稻瘟病菌致病相关发育十分重要。同时,试验证据表明MoSak1在上游激酶中占主导地位,而MoTos3起到辅助功能。5)MoAtg14是酵母Atg14高度分化的同源蛋白,是稻瘟病菌细胞自噬活性所必需的Atg14是PI3K复合体I的重要组分,引导PI3K在细胞自噬成核阶段发挥作用。运用一种综合的BLASTP方法,在稻瘟病菌数据库中找到一个与酵母Atg14相似度仅为21%的同源蛋白MoAtg14。同酵母Atg14一样,在MoAtg14的N端预测到一个复合螺旋区,试验结果表明MoAtg14通过该结构域与MoAtg6发生互作。在MoATG14缺失突变体中,细胞自噬过程被阻断,细胞自噬标记蛋白MoAtg8不能被降解。因此△Moatgl4表现出与其他细胞自噬突变体类似的表型,如菌落中央塌陷、产孢量下降和致病性丧失等。6)MoAtg14的复合螺旋区是MoAtg14功能所必需的在突变体MoAtg14-AC或MoAtg14-AN中,表达C端或N端序列缺失的MoAtg14,但这并不影响稻瘟病菌的菌落形态、产孢能力和致病性,并且有一定的细胞自噬活性。而复合螺旋区缺失的突变体MoAtg14-ACCD与△Moatg14表型一样,细胞自噬过程仍被阻断,说明MoAtg14的复合螺旋区是其功能所必需的。迄今为止,关于植物病原菌SNF1途径的研究主要集中在催化亚基MoSnfl及其对细胞壁降解酶的去抑制上,本研究首次揭示了稻瘟病菌SNF1途径其他组分的功能及其与过氧化物酶体和脂质代谢的关系；同时长久以来,由于Atg14的高度分化,对除酵母和哺乳动物以外其他生物Atg14的功能知之甚少,本研究证明了MoAtg14在稻瘟病菌中的作用机制及功能保守,为稻瘟病菌PI3K复合体及细胞自噬机制的研究奠定了理论基础。
【作者】曾晓清；
【导师】林福呈；
【作者基本信息】浙江大学，植物病理学，2014，博士
【关键词】稻瘟病菌；SNF1途径；过氧化物酶体；脂质代谢；细胞自噬；MoAtg14；致病性；

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