应用猪口腔液进行PRRSV中和抗体监测及纳米颗粒候选疫苗的评估

【摘要】猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)自1991年被鉴定以来,已经成为严重危害养猪业的主要疫病,目前在世界范围内每年都给养猪业造成上亿经济损失。口腔液是一种唾液和黏膜渗出液的混合物,包含来自血清和唾液腺的抗体。由于采集简单、费用低廉,用口腔液进行猪场疫病监测得到越来越多的应用。PRRSV特异性中和抗体在病毒的清除中发挥着重要作用,同时也是评估猪群PRRS免疫保护水平的主要指标。有研究证明可以从猪口腔液样品中检测到PRRSV病原和病毒特异性抗体。但是,迄今为止,应用猪口腔液来检测PRRSV中和抗体仍是空白。因此,本研究旨在建立一种应用猪口腔液进行PRRSV特异性中和抗体检测的试验方法。首先进行标准化试验,口腔液样品主要来自两个方面：猪场免疫PRRSV(?)蜀毒疫苗(PRRSV-MLV)后为期三个月间断性采集的口腔液样品；公猪免疫PRRSV-MLV或感染PRRSV-MN184当天及第21天采集的口腔液和血清样品。试验结果发现当口腔液中PRRSV中和抗体滴度大于1:8时是病毒特异的,而这种特异性中和抗体只有在免疫或者感染28天后才能从口腔液中检测到。为了验证该试验方法,从一个背景未知的猪场,采集了以栏为单位的口腔液样品共104份以及每栏有代表性的血清样品5份；另外,从4个不同育种猪场中,采集重复免疫的母猪血清样品以及对应母猪产下仔猪的口腔液样品各100份。检测结果显示,口腔液中的PRRSV中和抗体滴度与血清中和抗体滴度相关,可以从断奶后仔猪的口腔液样品中检测到PRRSV特异性母源中和抗体。当前现有的PRRSV商品化疫苗均存在不同的弱点,不能对猪群提供完全保护,开发新型PRRSV疫苗的研究仍在不断进行。本研究的另外一个目标是探索口腔液在实验室条件下评估候选疫苗效果时的作用。以二乙烯亚胺(binaryethylenimine,BEI)灭活PRRSV-VR2332病毒,选择性的将灭活的病毒抗原与荆豆凝集素(UlexEuropaeusAgglutinin,UEA)一起包埋于聚乳酸-聚羟乙酸(polylactide-co-glycolide,PLGA)中,制成纳米颗粒疫苗,然后将纳米颗粒疫苗分别与4种候选佐剂共同免疫实验动物,经2次鼻内喷雾接种后,用PRRSV-MN184进行攻毒试验以评价疫苗的交叉免疫保护能力。通过对黏膜相关组织(肺,支气管淋巴结,支气管肺泡灌洗液),血清以及口腔液的免疫相关性研究发现,第8试验组灭活VR2332纳米颗粒疫苗与4号佐齐(?)(NP-VR+Adjuvant4)产生的免疫效果较好,实验动物可以获得较好的交叉保护,具体表现为：(1)黏膜相关组织的PRRSVRNA拷贝数低,攻毒后第9天血清中的PRRSV被完全清除,攻毒后第15天口腔液中病毒RNA检测结果阴性；(2)肺和支气管肺泡灌洗液中检测到高滴度的PRRSV中和抗体,攻毒后第15天可以在口腔液中检测到中和抗体；(3)肺和支气管肺泡灌洗液中PRRSV特异性IgG应答显著增强,血清和口腔液中呈现高水平的IgA和IgG应答。这是应用口腔液样品与血清等其它样品一起筛选候选疫苗的首次尝试,口腔液中的PRRSVRNA拷贝数,中和抗体滴度和特异性IgA和IgG反应等结果为疫苗的免疫效果评估提供了重要参考价值。本研究建立了一种以猪口腔液为样品检测PRRSV特异性中和抗体的实验方法,其特异性和重复性分别达到94.3%和90.5%。本研究还通过口腔液中的PRRSVRNA拷贝数,中和抗体滴度和特异性IgA和IgG反应对候选纳米颗粒疫苗的免疫效果进行了评估,而这些试验结果对于疫苗的免疫效果评价是有效的。因此,猪的口腔液可作为PRRSV监控的诊断样品。
【作者】欧阳康；
【导师】吴健敏；GourapuraJ.Renukaradhya；
【作者基本信息】广西大学，预防兽医学，2013，博士
【关键词】猪繁殖与呼吸综合征；口腔液；中和抗体；黏膜免疫；PLGA纳米颗粒；交叉保护；

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