马铃薯候选寄主因子基因StTOM1-A、StTOM1-B和StTOM3的克隆和功能鉴定

【摘要】马铃薯是世界第四大粮食作物。广西马铃薯以冬种为主,这一时期正好填补国内鲜薯市场的空白,具有非常大的发展潜力。但是病毒病严重制约了广西马铃薯产业的发展。为了解广西冬种马铃薯病毒病的发生情况及发展马铃薯抗病毒育种新技术,本文开展了广西冬种马铃薯病毒病调查及其病原病毒鉴定以及克隆和功能分析马铃薯候选病毒寄主因子基因的研究。主要研究结果如下：1、广西冬种马铃薯病毒病害调查及病原病毒鉴定2010至2012年间对广西冬种马铃薯主要产区的病毒病发生情况进行了调查。田间疑似病毒病的发病率在2-10%之间。用病毒特异的RT-PCR方法进行检测,从2010年所采样品中检测到马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)和马铃薯S病毒(PotatovirusS,PVS);从2011年所采样品检测到PVY、PVS和马铃薯A病毒(PotatovirusA,PVA)。对2012年样品,在用间接ELISA初筛的基础上,用小RNA深度测序方法进行病毒鉴定,再用RT-PCR进行验证,共检测到PVY、PVS、PVA、马铃薯M病毒(PotatovirusM,PVM)、马铃薯H病毒(PotatovirusH,PVH)和马铃薯卷叶病毒(Potatoleafrollvirus,PLRV)等6种病毒和马铃薯纺锤体类病毒(Potatospindletuberviroid,PSTVd)。对PVS多个分离物进行序列分析,发现PVS有丰富的株系分化。2、马铃薯候选病毒寄主因子基因StTOM1-A、StTOM1-B和StTOM3的克隆和分析在马铃薯中克隆到拟南芥寄主因子基因AtTOM1和AtTOM3同源基因的cDNA和基因组DNA序列。其中,StTOM1-A基因的cDNA共有1227个核苷酸,包含一个849bp的编码区、一个34bp的5’非编码区和一个344bp的3’非编码区；StTOM1-BcDNA的全长为1287bp,编码一个含有289个氨基酸的开放阅读框,5’UTR为28bp,3’UTR为392bp;StTOM3基因的全长cDNA共1254bp,包含一个891bp的编码区,一个25bp的5’UTR,和一个338bp的3’UTR。获得了StTOM1-A、StTOM1-B和StTOM3基因组的全长DNA,分别为6475bp、7627bp和6245bp。其中StTOM1-A基因组DNA共含有10个外显子和9个内含子,外显子大小介于44bp到415bp之间,内含子介于76bp至1129bp之间；StTOM1-B全长基因组DNA含有11个外显子和10个内含子,外显子最小为44bp,最大为466bp,内含子最小为75bp,最大为2764bp;StTOM3全长基因组DNA共含有11个外显子和10个内含子,其中外显子大小介于41bp到403bp之间,内含子介于77至1241bp之间。序列和进化分析的结果表明,StTOMl-A、StTOM1-B和StTOM3与拟南芥、烟草、番茄中的寄主因子基因都有很高的同源性。疏水预测结果显示StTOM1-A,StTOM1-B和StTOM3都是7次跨膜蛋白。Southern杂交结果表明,StTOMl-A、StTOM1-B和StTOM3基因在马铃薯中都只有一个拷贝,时空表达结果显示,这三个基因在马铃薯中可以稳定表达。3、抗病毒转基因马铃薯新种质的构建分别构建了StTOM1-B、StTOM3单干扰的植物双元表达载体pBIStT1-Ri(±)和pBIStT3-Ri(±),以及StTOM1-B和StTOM3双干扰的植物双元表达载体pBIStT1-StT3-dRi(±),并通过农杆菌介导方法将其导入到马铃薯中。PCR和Southern杂交结果显示,获得了转StTOM1-B干扰的转基因马铃薯植株6棵,StTOM3干扰的转基因植株4棵,转StTOM1-B、StTOM3双干扰的转基因植株7棵。荧光定量PCR结果显示,植物双元表达载体转入后对转基因马铃薯中StTOM1-B和StTOM3mRNA的表达均有显著的抑制作用。在转pBIStT1-Ri(±)载体植株中StTOM1-B基因mRNA的表达水平仅为阴性对照的7.73%；在转pBIStT3-Ri(±)载体植株中StTOM3基因mRNA的表达水平仅为11.74%；在转pBIStT1-T3-Ri(±)载体植株中StTOM1-B的表达量为21.71%,StTOM3基因则为18.76%。病毒接种结果显示,转基因植株可以有效抑制TMV的侵染,但是对PVY、PVS和PVM则无明显的抑制作用,说明StTOM1-B和StTOM3基因在马铃薯中是支持TMV复制的寄主因子,却不是支持PVY、PVS和PVM复制的寄主因子。
【作者】宋静静；
【导师】陈保善；
【作者基本信息】广西大学，植物病理学，2014，博士
【关键词】马铃薯；寄主因子；病毒；转基因；RNAi；

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