大鼠脑死亡肾脏损伤和保护及脑—心双死亡供者器官捐献临床实践

【摘要】作为最成熟的器官移植,同种异体肾移植在近十几年内已成为首选的肾脏替代治疗手段,在存活时间、生存质量和经济效益比等方面均优于透析治疗。然而,供体器官短缺严重限制了我国肾移植规模进一步扩大。扩大供肾来源是我国乃至全球肾移植临床进一步发展的重要课题。脑死亡供体器官捐献对于我国肾移植临床事业进一步发展具有深远意义。目前,我国大量脑死亡患者的器官未得到利用,每年约13万人死于车祸,因各种疾病在医院处于脑死亡状态的患者数目更加庞大。因此,脑死亡供体肾移植将是我国器官移植领域重要的研究方向,并具有广阔的应用前景。作为复杂的病理进程,脑死亡对于肾脏的损伤机制尚不完全清楚。目前已知脑死亡可引起肾脏组织内微循环和能量代谢障碍、炎症反应加重、免疫状态增强、补体系统活化以及氧化应激损伤等,导致细胞凋亡、肾脏超微结构和组织病理学结构损伤及其功能改变。脑死亡产生全身炎症反应,血流动力学不稳定导致缺血再灌注,两者均是肾脏损伤的重要机制。探讨脑死亡状态下炎症反应和缺血再灌注等病理过程对肾脏的损伤机制,对于评估供肾质量、预测肾移植疗效以及指导靶向保护治疗等具有重要意义。本研究通过建立大鼠脑死亡模型评估脑死亡对肾脏的损伤,并动态观察脑死亡过程中的氧化应激损伤、炎症反应及其相关的信号通路,为脑死亡供体肾移植的相关临床诊断与治疗研究提供实验依据。在此研究基础上,本研究还首次采用我国中草药植物提取物—淫羊藿甙以及特异性MAPKs信号通路抑制剂SB203580处理脑死亡供体和肾移植受体,对供肾起到了较好的保护作用,也取得了较好的肾移植疗效。目前中国全国性的器官捐献系统的缺失导致了移植用器官的严重不足,在动物研究的基础上,建立一个国家层面的器官捐献体系势在必行。2010年卫生部联合中国红十字会决定以省红十字为单位开展心脏死亡器官捐献。河南省红十字会在无偿献血、造血干细胞捐献及遗体捐献有丰富的经验,在过去这些年使数万人受益。它在河南每个地市都有分支机构,拥有数百工作人员和几千名志愿者。同时,河南省作为一个人口大省有1亿多人,据估计有近十万终末期器官衰竭患者需要器官移植。为了缓解巨大的器官缺口,在取得河南省卫生厅的支持后,HRC开始进行器官捐献试点的探索工作,本研究第二部分就我省首批23例脑心双死亡捐献器官的应用进行了总结。第一部分大鼠脑死亡状态下肾脏损伤机制探讨摘要目的：研究大鼠脑死亡状态下肾脏损伤机制方法：1.根据国内外文献建立大鼠稳定型脑死亡模型[10-12]。2.按照我们的方法建立大鼠同种异体原位肾移植模型[13]。3.采用Fisher344大鼠作为供体。按照上述步骤建立大鼠脑死亡模型,维持脑死亡状态3h后,切取左侧肾脏作为供体器官。4.采用Lewis大鼠作为肾移植受体,Fisher344大鼠作为供体,进行同种异体原位肾移植。5.在诱导脑死亡前(0h)以及诱导脑死亡后21、4h、6h处死SD大鼠,经腹主动脉抽取外周血,室温静置30mmin后离心(10000g,20min),吸取上层血清冻存,用于生化检查。6.大鼠诱导脑死亡后,持续监测血压、心率。收集所有血清标本后,测定尿素氮和肌酐。采用ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子水平。7.用制备的cDNA标本,采用实时荧光定量PCR测定肾组织内炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)、趋化因子(MCP-1、MIP-2、IP-10)、转录因子(NF-κB、ATF3),以及细胞凋亡相关基因(Bcl-2、Bax)等的mRNA表达水平。8.采用western免疫印迹法测定肾组织内p38-MAPK、ERK1/2、JNK等蛋白的磷酸化水平,测定肾组织内ATF3蛋白表达水平。9.采用试剂盒测定组织髓过氧化物酶(MPO)活性(反映中性粒细胞浸润)以及丙二醛含量等。采用苏木素-伊红(H&E)染色进行组织病理学检查,用普通光学显微镜在400倍光镜下,随机选取5个视野,每个视野选择10个肾小管计分,光镜下肾小管病变程度采用Paller氏标准评分(表2-4)。10.丙二醛含量测定：采用硫代巴比妥酸法。结果：1.SD大鼠在诱导脑死亡后2h、4h、6h血清尿素氮、肌酐水平明显升高,与0h相比具有统计学差异(p<0.05)。并且随着脑死亡时间的延长,血清尿素氮和血清肌酐水平逐渐升高,各时间点之间比较具有统计学差异(p<0.05)。2.大鼠肾组织内ATF3mRNA随脑死亡时间延长而逐渐升高2.6～4.2倍,6h时最高；ATF3蛋白表达水平呈现出相似趋势,6h时增至3.4倍；ERK、JNK和p38MAPK蛋白磷酸化水平增加；p-ERK在4h达高峰,6h时降低；p-JNK在4h和6h水平相近；p-p38在6h时最高.STAT3蛋白磷酸化水平随脑死亡时间延长而增加；大鼠肾脏组织内促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10等细胞因子的mRNA表达水平明显升高,并在脑死亡后6h内呈时间依赖趋势。巨噬细胞趋化因子MCP-1、MIP-2、IP-10等mRNA表达水平在脑死亡4h后开始较明显升高,6h时达到高峰。3.肾脏组织内炎性转录因子NF-κB的mRNA表达水平逐渐升高,在4h左右达到高峰,6h时略有降低。采用ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性细胞因子的水平。IL-6水平显著升高。TNF-α水平未见明显升高；IL-1β水平升高不明显。脑死亡后肾组织内Bax/Bcl-2比值明显升高,并呈时间依赖性。大鼠脑死亡后肾组织内MPO含量明显升高,并呈时间依赖性；肾组织内MDA含量升高也很明显(p<0.01)。4.组织病理学检查显示,脑死亡6h后肾脏呈现明显的病理损伤。。结论：1成功建立大鼠稳定型脑死亡模型以及大鼠同种异体原位肾移植模型。2.SD大鼠在诱导脑死亡后与诱导脑死亡前2h、4h、6h,血清尿素氮、肌酐水平明显升高。并且随着脑死亡时间的延长,血清尿素氮和血清肌酐水平逐渐升高。3.记录了脑死亡过程中的氧化应激损伤、炎症反应及其相关的信号通路数据,为脑死亡供体肾移植的相关临床诊断与治疗研究提供实验依据。第二部分淫羊藿甙和p38-MAPK特异性抑制剂对脑死亡供肾损伤的保护作用摘要目的：研究淫羊藿甙和p38-MAPK特异性抑制剂对脑死亡供肾损伤的保护作用。方法：1.采用Fisher344大鼠建立脑死亡模型。2.诱导脑死亡后腹腔注射淫羊藿甙(100mg/kg/day)或p38-MAPK特异性抑制剂SB203580(1mg/kg/day),或两者联合用药。3.维持脑死亡3h后,处死大鼠按照上述供体肾脏准备程序取出肾脏作为供体。4.准备好供体肾脏后,立即以Lewis大鼠为受体,建立同种异体肾移植模型。5.手术当天(day0)及术后一周内每天给予淫羊藿甙(100mg/kg/day)或SB203580(1mg/kg/day)。进行实验分组和制定给药方案。观察各组移植物存活时间,检测相应的实验室指标。结果：1.淫羊藿甙、SB203580处理后,脑死亡供肾移植的移植物存活时间(中位数)从31.5天、36天延长至53.5天、52.5天；两者联合处理后,移植物存活时间(中位数)从35天延长至97.5天,50%的移植肾存活超过100天。2.肾移植术后第10天,淫羊藿甙组、SB203580组及联合处理组的移植肾功能较对照组有所降低,但无统计学差异(p>0.05)。3.按照Banff分级标准,分别从肾小球炎、肾小管病变、血管炎以及间质纤维化等方面对脑死亡供肾的组织病理学改变进行评分,每组各取3只大鼠,表3-1中所示为相应病理表现的动物数量。与各对照组比较,经淫羊藿甙或SB203580处理后,血管炎减轻最明显,肾小管萎缩也有所改善。血管炎和肾小管萎缩在联合处理组改善最明显。与对照组比较,药物处理组的间质纤维化改善不明显。结论：1.淫羊藿甙可明显延长脑死亡供肾移植的移植物存活时间,对供肾起到了较好的保护作用。2.SB203580可明显延长脑死亡供肾移植的移植物存活时间,对供肾起到了较好的保护作用。3.两者联合处理后,移植物存活时间(中位数)比单独应用淫羊藿甙、SB203580处理后脑死亡供肾移植的移植物存活时间(中位数)明显延长。第三部分河南省脑死亡加心死亡供者器官捐献23例总结目的：总结河南省脑死亡加心死亡(Donationafterbraindeathandcardiacdeath,DBCD)器官捐献中的经验,探索中国器官捐献的规范化模式。方法：联合河南省红十字会及卫生厅建立器官捐献办公室,以中国三型脑-心双死亡为死亡标准,参照国家相关组织架构建立组织,采取多种宣传方法,以红十字会工作人员组成的协调员队伍为核心,以《中国心脏死亡器官捐献指南》为行动标准,在河南地区开展人体器官捐献工作。结果：1.自2010年7月1日至2012年9月30日,河南省器官捐献办公室收到有效器官捐献申请书1000余份。共接到符合标准的潜在DCD供者申请95例。潜在供者原发病主要为交通意外外伤(51/95,53.7%)、其他意外外伤(17/95,17.9%)、自发性脑出血(15/95,15.8%)及头颅肿瘤(5/95,5.3%)及其他(6/95,6.3%)；获知器官捐献的途径主要为协调员告知(69/95,72.6%)及由媒体或宣传品获得(26/95,27.4%)。没有成功案例72例,原因包括家属同意后反悔(32/72,44.4%)、与交通部门、医院行政部门协调问题(15/72,20.8%)、家属中有人反对(9/72,12.5%)、严格医学检查不符合脑死亡(7/72,9.7%)、严重器官功能衰竭(6/72,8.3%)和供者突然死亡(3/72,4.2%)。家属意见不一致的9例患者中,2例潜在捐献者家属同意患者死亡后捐献角膜。2.成功实施DCD器官捐献23例(23/95,24.2%)及遗体角膜捐献2例,共捐献肝脏18个,肾脏44个,胰腺1个,角膜16个,分流至5家医院的6个移植中心,所有手术均顺利完成。23例成功捐献案例的原发病以脑外伤为主(60%)；3.我院完成DCD肾脏移植23例,手术均顺利完成,术后免疫抑制方案均为他克莫司、骁悉联合强的松,一例患者术后早期发生急性排斥反应后移植肾破裂大出血,给予切除移植肾并行再次肾移植术,15天后患者死于DIC；肾脏移植术后急性排斥反应发生率为4/23,移植肾脏延迟回复发生率为7/23。结论：我们按照国家相关规定,在河南探索建立了一个完整的器官捐献系统,公正、透明、无害且可行性强,推广后更多的器首衰竭患者将获益于这个系统。
【作者】尚文俊；
【导师】乔保平；
【作者基本信息】郑州大学，外科学，2013，博士
【关键词】大鼠；脑死亡；心脏死亡；肾脏损伤；肾脏移植；器官保护；炎性因子；组织病理学检查；器官捐献系统；

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