诱导多能干细胞来源的神经干细胞移植治疗脑出血的实验研究

【摘要】脑卒中具有高发病率、高死亡率、高复发率和高致残率“四高”特点，是严重威胁人类健康的重大常见疾病。其中，脑出血（ICH）的致死率和致残率比脑缺血高，经常遗留更为严重的持续性神经功能障碍。现有针对ICH的临床治疗手段，包括药物治疗和外科手术治疗，主要目的是支持治疗和防治并发症，缺乏直接针对ICH病理生理所致损伤的有效特异性治疗手段，治疗效果有限。由于神经元的不可再生性、内源性NSCs数量稀少等原因，神经系统在ICH损伤后自身修复的能力十分有限。因此，采用干细胞移植治疗以恢复或重建ICH受损的中枢神经系统的结构和功能，已成为近年来倍受研究者们关注的具有极大应用潜力的治疗方案之一。新现的诱导多能干细胞(iPSCs)技术给ICH治疗带来了新的希望。ICH患者特异的、个体化的iPSCs及其来源的NSCs移植能够避免异体细胞移植面临的免疫排斥和伦理等难题，在治疗难治性ICH方面具有较大应用潜力。本实验研究的目的是首先将重症ICH患者皮肤成纤维细胞体外重编程为iPSCs，接着将iPSCs体外定向诱导分化为NSCs，最后在ICH模型大鼠体内评估iPSCs来源的NSCs移植治疗的效果和可能机制，为利用ICH患者自体iPSCs及其来源的NSCs进行个体化的移植治疗奠定理论和应用基础。第一部分诱导多能干细胞的诱导及鉴定目的：将重症ICH患者皮肤成纤维细胞体外重编程为iPSCs并对其进行体内体外的系列鉴定。方法：①经患者及家属知情同意后，采用钻取活组织检查术采集一名ICH患者4mm2皮肤样本；②酶消化法分离皮肤成纤维细胞，并进行培养扩增；③使用分别携带人OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc基因的慢病毒感染成纤维细胞，使之形成iPSCs样细胞克隆团；④对iPSCs样细胞克隆团进行鉴定：碱性磷酸酶(AP)染色，免疫荧光染色检测表达hESCs特异蛋白Oct4、SOX2、SSEA4、TRA-1-60和Nanog，拟胚体（EB）形成实验体外鉴定其多分化潜能，畸胎瘤形成实验体内鉴定其多分化潜能和体外连续传代检测其自我更新能力。结果：①ICH患者皮肤成纤维细胞被诱导为类ESCs克隆；②类ESCs克隆呈现与hESCs相似的表型和特性：克隆形态相似，AP染色强阳性，持续表达Nanog、OCT4、SOX2、SSEA-4和TRA-1-60等hESCs多潜能标志；③类ESCs克隆具有与hESCs相似的多能性：体外形成EBs并表达三胚层细胞标志AFP、a-SMA、Desmin、β-ⅢTubulin和GFAP，在SCID鼠肌肉内形成包含三胚层组织的畸胎瘤；④iPSCs具有自我更新能力。结论：ICH患者皮肤成纤维细胞被体外重编程为iPSCs。第二部分体外诱导iPSCs定向分化为NSCs目的：将ICH患者皮肤成纤维细胞来源的iPSCs体外定向诱导为NSCs。方法：首先将iPSCs体外诱导形成EBs，接着将EBs诱导形成神经管样结构，再形成球状NSCs细胞克隆团。对神经球NSCs进行形态、表达Nestin、自我更新能力和向特定神经细胞定向分化的能力等鉴定。结果：iPSCs经过从EBs和玫瑰花结样的神经管样结构阶段，最终形成含大量NSCs的球状细胞克隆团。经鉴定，神经球形态与从脑部分离的NSCs球状克隆团非常相似，持续表达NSCs特异标志蛋白Nestin，具有自我更新能力和向神经元样及胶质细胞样细胞等神经细胞定向分化的能力。结论：ICH患者皮肤成纤维细胞来源的iPSCs体外被定向诱导分化为NSCs。第三部分iPSCs来源的NSCs移植改善ICH模型大鼠神经功能障碍目的：探讨iPSCs来源的NSCs移植治疗大鼠实验性ICH的效果及其可能机理。方法：将BrdU预先标记的iPSCs来源的NSCs通过脑立体定向注入ICH模型大鼠脑血肿周围，随后通过mNSS和MLPT评分等行为学评分定期评估ICH模型大鼠神经功能恢复情况，并通过免疫荧光染色技术检测移植的NSCs在ICH大鼠脑内的存活、移行和向神经细胞分化等状况。结果：与对照组相比，NSCs移植组大鼠mNSS和MLPT评分在ICH后第14天有显著降低(P＜0.05），并持续至ICH后第28天(P＜0.05），表明NSCs移植组大鼠行为能力得到有效改善。免疫荧光染色结果显示，移植的NSCs不仅能够移行到ICH模型大鼠脑血肿周围组织内存活达27天，而且能分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞。结论：iPSCs来源的NSCs移植可能通过神经细胞替代机制发挥改善ICH模型大鼠神经功能障碍的治疗作用。
【作者】秦洁；
【导师】许予明；
【作者基本信息】郑州大学，神经病学（专业学位），2014，博士
【关键词】脑出血；诱导多能干细胞；神经干细胞；神经功能障碍；神经细胞替代；

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