LRIG3在宫颈鳞癌组织中的表达及体内外干扰LRIG3表达的实验研究

【摘要】背景宫颈癌是全世界范围内同时也是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生率位居女性生殖系统恶性肿瘤第一位，且有逐年年轻化的趋向。近年来，随着手术切除、化学治疗、放射治疗、及其它综合性治疗措施的应用，对宫颈癌的治疗有了一定程度的进展，但疗效并不十分理想。宫颈癌的病因及发生机制目前尚不十分明了，许多研究证明其发生、发展和浸润、转移是多因素、多阶段、多基因共同参与的非常复杂的过程，因此，探讨宫颈癌的发病机制，寻找更有效的治疗措施是当前研究的热点课题之一。LRIGs是最近发现的一组肿瘤相关基因，该家族共有三个成员：LRIG1、LRIG2、LRIG3。LRIGs编码一组结构上较为相似的膜整合蛋白，蛋白分为胞外段、跨膜区和一个胞浆内尾巴，胞外段蛋白含有富含亮氨酸重复序列（LRRs）和3个免疫球蛋白样结构域。研究表明LRIG的表达能够对EGFR信号通路进行调控，从而起到抑制肿瘤生长的作用，但是我们对其分子和信号机制尚不清楚。近年来许多研究表明，LRIGs基因家族在垂体瘤、神经胶质瘤和皮肤鳞状细胞癌等多种肿瘤中具有抑癌作用。LRIG3定位于人类基因组12q13，在人类肿瘤中LRIG3是高表达还是低表达尚不十分清楚，对于其在宫颈癌中表达的相关研究较少，对于其在宫颈癌细胞株中发挥的生物学作用尚未见报道。LRIG3和宫颈癌的发生发展是否有相关性，抑制LRIG3表达对宫颈鳞癌的影响是本研究需要探讨的核心。目的检测宫颈鳞癌组织、宫颈上皮内瘤变组织和正常宫颈粘膜组织中LRIG3、EGFR和Ki67的表达，并分析其与宫颈鳞癌浸润转移的关系。观察LRIG3反义核苷酸转染到宫颈癌Hela229细胞中后对LRIG3和EGFR的表达以及对细胞增殖、转移以及细胞周期的影响。观察LRIG3反义核苷酸对宫颈癌裸鼠移植瘤的影响。第一部分LRIG3在宫颈鳞癌组织中的表达及意义方法应用免疫组织化学和原位杂交检测45例宫颈鳞癌组织、20例CIN组织和30例正常宫颈黏膜组织中LRIG3、EGFR和Ki67表达，并结合临床病理资料对结果进行分析。结果1.LRIG3蛋白和mRNA在宫颈鳞状细胞癌组织中的阳性表达率分别为35.56%和48.89%，显著低于CIN组织（分别为70%、80%）和正常宫颈粘膜组织（皆为100%），两两间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。其蛋白和mRNA的表达强度与/和患者的年龄以及肿瘤大小无关（P均>0.05），而与肿瘤的浸润程度、临床分期以及淋巴结转移成负相关（P均<0.05）。2.EGFR蛋白和mRNA在宫颈鳞状细胞癌组织中的阳性表达率分别为80%和84.44%，显著高于CIN组织（分别为35%、45%）和正常宫颈粘膜组织（分别为6.67%、16.67%），两两间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。在宫颈鳞状细胞癌组织中EGFR蛋白和mRNA的表达强度与患者的年龄、肿瘤大小、临床分期无关（P均>0.05），而与肿瘤的浸润程度以及淋巴结转移成正相关（P均<0.05）。3.Ki67蛋白和mRNA在宫颈鳞状细胞癌组织中的阳性表达率分别为86.67%和91.11%，显著高于CIN组织（分别为30%和50%）和正常宫颈粘膜组织（分别为3.33%、23.33%），两两间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Ki-67的表达与宫颈鳞癌各临床病理因素均无相关性((P>0.05)。4.LRIG3和EGFR在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达呈负向相关,LRIG3和Ki67在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达亦呈负向相关。第二部分LRIG3的表达调控对宫颈鳞癌Hela229细胞周期、凋亡、侵袭力的影响方法1.设计合成LRIG3反义寡核苷酸（LRIG3ASODN）、正义寡核苷酸序列（LRIG3SODN）以及错义寡核苷酸序列（LRIG3MSODN），用脂质体Lipofectamine2000包裹转染Hela229细胞，作为转染组细胞。将脂质体转染的细胞作为空白对照组细胞。2.Westernblot检测不同浓度(150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml)LRIG3ASODN、LRIG3MSODN和LRIG3SODN转染细胞24h、48h及72h后LRIG3和EGFR蛋白表达情况。3.RT-PCR检测不同浓度(150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml)LRIG3ASODN、LRIG3MSODN和LRIG3SODN转染细胞24h、48h及72h后LRIG3和EGFRmRNA表达情况。4.应用MTT检测细胞增殖情况，细胞流式法测定细胞凋亡，细胞基质粘附实验检测细胞粘附能力，Transwell小室法检测细胞的侵袭能力。结果1.ASODN组中LRIG3蛋白和mRNA表达较SODN组、MSODN组、空白对照组明显降低（P<0.05），且有浓度依赖性和时间依赖性，LRIG3的表达随转染浓度的增加以及时间的延长而减少。2.ASODN组中EGFR蛋白和mRNA表达较SODN组、MSODN组、空白对照组明显增加（P<0.05），随转染浓度的增加及时间的延长EGFR的表达随之升高。EGFR表达和LRIG3表达呈负相关。3.MTT实验表明LRIG3ASODN组Hela229细胞增殖率较其它组别明显升高（P<0.05），随着LRIG3ASODN转染浓度增加，表达抑制时间延长，细胞增殖率明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。4.转染LRIG3ASODN后Hela229细胞凋亡率明显降低，随着转染浓度的增加，时间延长，细胞的凋亡率随之降低。5.细胞基质粘附实验表明转染LRIG3ASODN后使Hela229细胞粘附率明显增高，随着转染浓度的增加，时间延长，细胞的粘附率随之升高。6.Transwell实验表明转染LRIG3ASODN后使得Hela229细胞的迁徙能力明显增高，ASODN组穿膜细胞数（246±10）明显高于SODN组（168±10）、MSODN组（177±8）和空白对照组（176±6）。第三部分LRIG3表达调控对人宫颈鳞癌裸鼠移植瘤生长的影响方法将1×107个Hela229细胞注射到裸鼠皮下构建宫颈鳞癌裸鼠移植瘤模型，将LRIG3ASODN皮下注射到瘤体内后观察裸鼠移植瘤的生长状态。测量各组种植瘤瘤体体积。Westernblot和RT-PCR检测裸鼠移植瘤中LRIG3和EGFR蛋白和mRNA表达。结果1.ASODNLRIG3组注射后18-30天裸鼠细胞瘤体积较其它两组明显增高（P<0.05）。2.Westernblot和PT-PCR检测裸鼠移植瘤中LRIG3蛋白和mRNA表达，显示ASODN组LRIG3表达较MSODN和空白对照组明显降低（P<0.05）。3.Westernblot和PT-PCR检测裸鼠移植瘤中EGFR蛋白和mRNA表达，显示ASODN组EGFR表达较MSODN和空白对照组明显升高（P<0.05）。结论1.宫颈鳞癌组织和CIN组织中LRIG3呈低表达，EGFR高表达，其表达量与宫颈鳞癌的浸润和转移密切相关。提示LRIG3通过对EGFR的负反馈调节起到抑制宫颈鳞癌发生发展的作用。2.LRIG3ASODN能显著下调宫颈鳞癌Hela229细胞中LRIG3蛋白和mRNA的表达，同时EGFR蛋白和mRNA表达上升，能抑制宫颈鳞癌细胞凋亡，增强细胞侵袭能力。提示LRIG3在宫颈鳞癌细胞增殖、凋亡及侵袭力中起着重要作用。3.LRIG3ASODN可导致宫颈鳞癌裸鼠成瘤速度加快，体积增加，同时移植瘤组织中LRIG3蛋白和mRNA的表达显著降低，EGFR蛋白和mRNA表达增高。
【作者】郭历琛；
【导师】史惠蓉；
【作者基本信息】郑州大学，妇产科学，2014，博士
【关键词】LRIG3；EGFR；宫颈鳞癌；反义寡核苷酸；Heal229细胞；裸鼠移植瘤；

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