生命早期铅暴露在阿尔茨海默病样变进程中的作用及分子机制

【摘要】阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease,AD)是最为常见的引起老年痴呆的脑部神经退行性疾病。但迄今为止，病因和发病机制仍不明确，提出了许多假说。其中β淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)级联假说占主导地位，认为Aβ凝集和聚积是AD病理发生、发展的始动因素和中心环节，可能是各种因素导致AD的共同途径。因此围绕Aβ展开对AD发生、发展进程中的各种影响因素及其调节的机制探讨是目前研究的热点。铅是环境中普遍存在的具有神经毒性的重金属。神经系统发育阶段对铅尤为敏感。人群流行病学研究发现慢性职业铅暴露和其他金属接触与阿尔茨海默症、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和精神分裂症等有关。同时，动物实验研究显示发育早期铅暴露是脑内的淀粉样变的危险因素。可见铅可能通过影响Aβ的代谢而导致AD样病变。因此研究运用生命早期铅暴露小鼠模型，探讨早期铅暴露引起的迟发神经毒性效应及铅在AD样变发生进程中的作用，从而为AD的病因及发病机制研究提供科学依据。目的1建立生命早期铅暴露动物模型，应用水迷宫实验，观察增龄过程中小鼠空间学习记忆能力的变化，从而为判定早期铅暴露对小鼠中枢神经系统损伤提供依据。2分析生命早期铅暴露对不同月龄小鼠海马组织β淀粉样前体蛋白(β-amyloidprecursorprotein,APP)基因、β-内分泌酶1(β-secreatase-1,BACE1)、早老素-1(Presenilin-1,PS1)的mRNA水平和蛋白表达水平的影响及海马组织中Aβ的含量的变化，探讨铅暴露对淀粉样蛋白生成的影响。3评估铅暴露对不同月龄小鼠海马组织整体DNA甲基化水平及APP、PS1基因启动子区DNA甲基化状态的影响，分析铅暴露导致AD样病变可能的分子机制，为铅暴露神经毒性分子机制和AD的发病机制提供新的理论依据。材料与方法1研究对象清洁级成年C57BL/6小鼠90只(雌60只，雄30只)，按雌:雄=2:1合笼饲养，以获得孕鼠。孕鼠单笼饲养，待其分娩后取雄性仔鼠作为研究对象。仔鼠随机分为4组，每组80只，分别是生长发育期铅暴露组(DP组)：孕鼠饮0.2%醋酸铅水染毒后经母乳给仔鼠染毒直至断乳（21d）。成年期铅暴露组(AP组)：仔鼠第6月龄开始饮0.2%醋酸铅水3个月。生长期和成年期共同暴露组(DAP组)：孕鼠饮0.2%醋酸铅水染毒后经母乳给仔鼠染毒直至断乳（21d）后，再至其第6月龄开始饮0.2%醋酸铅水3个月。对照组(C组)：给予无铅去离子水。2方法2.1采用石墨炉原子吸收光谱法测定小鼠血液、海马组织铅的含量。2.2采用Morris水迷宫实验测定1月龄、6月龄、12月龄、18月龄小鼠空间学习记忆能力。2.4采用Real-timePCR、Westernblot技术分别检测1月龄、6月龄、12月龄、18月龄小鼠海马组织中APP、PS1、BACE1的mRNA水平和蛋白表达水平。2.3采用Elisa法检测1月龄、6月龄、12月龄、18月龄小鼠海马组织中Aβ1-40和Aβ1-42的含量。2.5采用高效液相法检测铅暴露小鼠海马组织中基因组DNA甲基化水平。2.6采用MS-PCR技术检测小鼠海马组织APP基因、PS1基因启动子区DNA甲基化状态。3统计学分析使用SPSS21.0统计软件包进行统计分析；数据以均数士标准差表示，Morris水迷宫中的逃避潜伏期用重复测量数据方差分析，其余变量用单因素方差分析，当多组样本均数间总体方差分析有差异时，组间两两比较用LSD法分析组间差异。相关性采用Pearson相关分析，检验水准为a=0.05。结果1生命早期铅暴露对小鼠学习记忆能力影响1.1血铅和海马铅含量测定结果显示，1月龄和6月龄时，DP组和DAP组血铅和海马铅水平均高于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；12月龄和18月龄时，AP组和DAP组染毒结束，血铅和海马铅水平增高，DP组、AP组和DAP组与C组相比，差异均有统计学意义(均P<0.05)。1.2水迷宫实验结果显示，1月龄和6月龄时，DP组和DAP组小鼠第三天至第五天的逃避潜伏期均较C组和AP组长，差异有统计学意义(均P<0.05)。12月龄和18月龄时，AP组和DAP组染毒结束，与C组比，铅暴露各组小鼠第三天至第五天的逃避潜伏期差异均有统计学意义(均P<0.05)，DAP组逃避潜伏期最长；铅暴露各组跨越平台次数差异均有统计学意义(均P<0.05)。2生命早期铅暴露对淀粉样蛋白生成的影响2.1Real-timePCR结果显示APP、BACE1和PS1mRNA表达量在1、6月龄时DP组和DAP组与C组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)；在12月龄和18月龄时，DP组、AP组和DAP组均高于C组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。随着年龄增长，APP、BACE1和PS1mRNA在DP组、AP组和DAP组的表达量均逐渐升高，且差异均有统计学意义(均P<0.05)。2.2Westernblot结果显示，APP蛋白、BACE1蛋白和PS1蛋白表达量在12和18月龄时DP组AP组和DAP组均高于C组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。不同暴露组间APP蛋白、BACE1蛋白两两比较显示，DP组与AP组，DP组与DAP组，AP组与DAP组表达差异均有统计学意义(均P<0.05)。PS1蛋白在铅暴露组间两两比较差异无统计学意义(均P＞0.05)。随着年龄增长，DP组、AP组和DAP组的APP、BACE1、PS1蛋白表达量逐渐升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。2.3不同组小鼠海马组织Aβ1-40、Aβ1-42的含量结果显示，1月龄和6月龄时，Aβ1-40、Aβ1-42的含量在各组间差异无统计学意义(均P＞0.05)；在12月龄和18月龄时，DP组、AP组和DAP组与C组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，且随着年龄的增长而呈上升趋势。3生命早期铅暴露对小鼠海马组织基因组DNA甲基化水平的影响3.1基因组DNA的甲基化水平比较结果显示，不同组小鼠海马组织基因组DNA的甲基化水平随着年龄的增长而逐渐降低；1月龄和6月龄时，DP组、DAP组与C组比较，差异有统计学意义(均P<0.05)；12月龄时，DP组、AP组和DAP组与C组比较，差异有统计学意义(均P<0.05)，DNA的甲基化水平分别降低1.2%、1.4%、2.0%；18月龄时，DP组、AP组和DAP组与C组比较，差异有统计学意义(均P<0.05)，DNA的甲基化水平分别降低2.0%、1.5%、2.3%。呈低甲基化状态。不同月龄小鼠海马组织APP基因启动子甲基化水平在各组间差异有统计学意义(均P<0.05)。铅暴露组组间两两比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)。不同月龄小鼠海马组织PS1基因启动子甲基化水平在各组间差异有统计学意义(均P<0.05)；不同铅暴露组间两两比较，差异均无统计学意义(均P＞0.05)。结论1生命早期铅暴露可使小鼠血铅和海马铅含量升高，后期排出较慢。2生命早期铅暴露能够损伤小鼠的学习记忆能力，即便是在去除了铅暴露这个危险因素后也将持续存在学习记忆能力的损害。3生命早期铅暴露可造成小鼠大脑海马组织中APP过度表达，同时海马组织中BACE1、PS1的表达增高，而导致Aβ生成增多。4铅暴露可降低小鼠海马组织基因组DNA的甲基化水平；APP基因、PS1基因启动子区呈低甲基化状态。
【作者】刘芳丽；
【导师】李文杰；
【作者基本信息】郑州大学，流行病与卫生统计学，2014，博士
【关键词】铅阿尔茨海默病；学习记忆；β-淀粉样蛋白；DNA甲基化；

【参考文献】
[1]许锦慧.术后辅助放化疗对胃癌预后的Meta分析[D].广西医科大学,肿瘤学（专业学位）,2013,硕士.
[2]杨晓菲.江苏省游泳裁判员队伍的现状调查与发展对策研究[D].中国矿业大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[3]费浩杰,包华,杨重阳,王庚超.用于柔性超级电容器的凝胶聚合物电解质膜的制备[J].功能高分子学报,2013,02:174-178+185.
[4]王晓璐,左剑恶,干里里,邢薇,缪恒峰,阮文权.复合填料生物渗滤系统处理城市雨水径流的研究[J].环境科学,2015,07:2518-2524.
[5]马玲,赵双群,王战宏,买学锋,赵玉林.热等静压温度对铍铝合金显微组织及力学性能的影响[J].飞航导弹.2006(08)
[6]罗贤宇.石墨烯负载贵金属纳米催化剂的制备及催化氧化性能[D].华南理工大学,2013.
[7]李岭.粮仓温湿度测控系统下位机的设计[D].河北大学,集成电路工程,2014,硕士.
[8]张善金.耕地等别划分方法研究[D].福建师范大学,自然地理学,2004,硕士.
[9]陈彩彦.我国西北地区中小型物流企业的市场定位与发展研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[10]相军伟.环境法律制度在甘肃省实施情况调查研究[D].兰州大学,环境法,2012,硕士.
[11]陈寒冰.超声造影在肾癌诊断中的应用评价[D].苏州大学,影像医学与核医学（专业学位）,2013,硕士.
[12]张玮.金钗石斛生物总碱对Aβ_(25-35)所致原代大鼠神经元损伤的保护作用[D].遵义医学院,药理学,2013,硕士.
[13]赵凡.Exploring Conversation Strategies in TV News Talk Show[D].华中师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[14]章坚民,吴鑫淼,陈耀军,肖丰,王剑辉,章法源.供电公司移动作业排班调度优化模型及算法[J].电力系统自动化,2013,14:81-88.
[15]张文学.应用合作学习法提高高中生英语写作能力的探究[D].河北师范大学,学科教学,2013,硕士.
[16]张俊哲.循环肿瘤细胞自动化检测设备的研制[D].武汉纺织大学,电磁场与微波技术,2014,硕士.
[17]滕野.基于VCSEL短距离多模光纤通信的建模与仿真[D].北京邮电大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[18]罗远刚.三维平差技术在高铁轨道控制网测量中的应用研究[D].西南交通大学,大地测量学与测量工程,2014,硕士.
[19]郭增革,李健,程博闻,张斌,唐兵兵,李鑫.压力对PET/PA6共聚物流变行为的影响[J].高分子材料科学与工程.
[20]黄道平,朱学峰.一种预测优化解耦补偿器的研究设计[J].自动化学报,2000,02:250-253.
[21]朱美霖.特异性激活SHH通路对急性脑缺血大鼠血管再生影响[D].郑州大学,神经病学,2013,硕士.
[22]郭瑞,李国平,安明喆,韩松.内养护技术对不同强度等级高性能混凝土性能的影响[J].中国铁道科学,2015,03:24-29.
[23]王秀妍.温压联合作用下海底管线水平向整体屈曲的高阶模态分析[D].天津大学,岩土工程,2013,硕士.
[24]卢樟锋,杜胜吉,方家宏,潘志超,江涛,唐绍春.建筑淤土免烧陶粒的绿色度评价[J].山西建筑,2015,01:113-114.
[25]陈熙.抑前胸腺肽结构与生理作用机制的研究[D].浙江大学,生物物理,2004,硕士.
[26]杨睿.工程造价模糊智能控制及措施推理研究[D].西安建筑科技大学,工程经济与管理,2013,硕士.
[27]舒立三.伪连续导电模式二次型Boost变换器研究[D].西南交通大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[28]肖洁.论房屋租赁关系中权利冲突的认定及解决[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[29]蒋璠.数据仓库技术及其应用现状与前景[J].中国保险管理干部学院学报,2004,06:53-54.
[30]方璐.通辽市征地补偿方式的研究[D].中国地质大学（北京）,公共管理,2014,硕士.
[31]郭凤娟.我国公共文化服务体系建设中的财政转移支付制度研究[D].中国艺术研究院,艺术学,2014,硕士.
[32]夏尚钰.船艉涡通气及舵绕流分离对舵效影响的研究[J].舰船科学技术.1993(03)
[33]吴晓莲.自动供螺钉装置设计与研究[D].陕西科技大学,材料加工工程,2013,硕士.
[34]陈曦.新媒体时代我国传统电视媒体的广告价值研究[D].南京师范大学,传播学,2012,硕士.
[35]高天天.保险公司全面风险管理导向的内部控制应用研究[D].首都经济贸易大学,会计（专业学位）,2014,硕士.
[36]冯卫东.超材料石墨烯开发取得重大突破[J].中国粉体工业,2010,01:44-45.
[37]桑滨.基于网络视角的顾客—企业知识协同演化研究[D].杭州电子科技大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[38]孟晗.解禁企业间借贷的法律思考[D].浙江大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[39]张钰晨.黄生《杜诗说》的诗学思想[D].宁夏大学,中国古代文学,2014,硕士.
[40]李永庚,于振文,梁晓芳,赵俊晔,邱希宾.小麦产量和品质对灌浆期不同阶段低光照强度的响应[J].植物生态学报,2005,05:807-813.
[41]郭紫燕.物欲的审思：宁浩电影研究[D].华东师范大学,电影学,2013,硕士.
[42]奥克贺.蒙古与中国经贸合作问题研究[D].黑龙江大学,国际贸易学,2013,硕士.
[43]曹书通.高中地理课堂教学目标设计及改进策略研究[D].华中师范大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[44]陈伟,周頔,孙俊,须文波.一种采用完全学习策略的量子行为粒子群优化算法[J].控制与决策,2012,05:719-723+730.
[45]陈峥.成人固有颈部肌肉骨骼系统的高频超声检查[D].遵义医学院,影像医学与核医学（专业学位）,2013,硕士.
[46]贾朴.电动车用永磁同步驱动电机控制方法的研究[D].大连理工大学,车辆工程,2013,硕士.
[47]王想到.玉米联合收割机总体分析及底盘结构优化[D].河南科技大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[48]黄伟,纪双全.基于馈线偶的配电网快速减小网损重构方法[J].电力系统自动化,2015,05:75-80.
[49]胡维佳.The Role of the Target-Text Addressee in Translation[D].浙江大学,英语语言文学,2004,硕士.
[50]蔡浩.β，β直接桥联的卟啉阵列的合成与性能研究[D].湖南师范大学,有机化学,2014,硕士.