促红素衍生肽ARA290对大鼠移植肾早期损伤的保护作用及机制研究

【摘要】随着器官移植领域技术的飞速发展,肾移植成功率不断提高，肾移植已成为治疗终末期肾病（Endstagerenaldisease，ESRD）的有效方法。但临床肾移植过程中，移植肾在切取、灌注、保存等过程中不可避免的要发生一定程度的损伤，其中缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤是最重要的,并且在早期移植肾组织活检发现缺血再灌注损伤与促炎症状态有关，与移植物长期存活以及排斥反应的发生有直接的关系。研究证实在I/R中，核因子-κB（NF-κB）的激活起了重要的作用。NF-κB是一种重要的转录因子，研究显示NF-κB广泛参与多种炎性因子基因的转录表达的调控，可导致细胞的过渡活化并诱发损伤。Sung等研究发现在肾脏缺血期NF-κB就被激活，并且在再灌注的15min时达到高峰，NF-κB对组织的早期的炎症起重要作用。近年的研究发现，促红素（Erythropoietin，EPO）除了对造血系统的造血作用外，EPO在各种器官的缺血再灌注损伤中有显著的组织保护作用，包括肾、心脏、肝脏和中枢神经系统等，证实在缺血再灌注前后给予促红素可起到保护作用。在肾脏中，研究发现应用EPO可以减轻肾脏的缺血再灌注损伤，促红素具有很好的抗炎、抗凋亡作用，并且这些保护作用是剂量依赖的，从而对肾脏起到即刻保护作用。EPO保护组织的可能的机制是通过受体与配体结合相互作用的方式来发挥其效用的。在缺血状态下，EPO受体表达将会显著增加。EPO在细胞内可以有多种信号传导途径。已发现EPO可以激活NF-κB,并且目前发现的可能参与EPO组织保护作用的信号分子途径有多种，如PI3/Akt，JAK2及MAPKs等均可引起NF-κB的活化，EPO的受体复合物（(erythropoietinreceptro，EPO-R）包括2个经典型的（EPOR）2和2个β型的受体βcR2(β-commonreceptor,βcR)。EPO与传统的EPO同源二聚受体(EP0R)2结合能力要比具有保护性亚单位的EPOR2-βcR2的结合能力强，因此启动组织的保护作用需给予更高剂量的EPO。但高剂量EPO带来的副作用也是很明显的，如心血管事件发生率增加、血栓形成的风险增加、肿瘤细胞的生长等，因此限制了其在临床中对保护组织的广泛应用。MBrines等研究发现在小鼠心肌细胞上存在保护性受体亚单位βcR（CD131），能与EPO受体亚单位,EPO-R形成异源二聚受体复合物，通过激活不同的信号通路，进而发挥减轻炎性反应、抗细胞调亡，对组织和器官发挥保护作用，但不启动造血信号通路的传导，因此为了避免EPO的不良反应，各种的EPO衍生物研发能独立于促红素的传统的结合位点而和EPOR2-βcR2受体复合物结合发挥组织保护作用。ARA290是最新的EPO类似物衍生肽，含有11种氨基酸序列，在空间上组成线性多肽，能独立于促红作用位点而发挥组织保护作用。目前有少量的研究证实，ARA290在肾、脑缺血再灌注损伤中都有很好的组织保护作用，并且没有高剂量EPO带来的明显的副作用。尽管上述对ARA290的研究已取得初步进展,并且表现出了很好的组织保护作用，但应用ARA290预处理供体供肾并且观察其在移植后移植肾早期损伤中的作用研究尚未见报道。因此本研究拟模拟临床肾移植条件及过程，将ARA290加入UW器官保存液中，在4℃低温保存条件下对供肾进行预处理，并建立异体大鼠肾移植模型，观察移植术后对肾脏的保护作用，应用分子生物学方法检测移植术后移植肾炎性因子mRNA的表达以及可能的NF-κB的信号机制，探讨应用促红素衍生肽ARA290处理肾移植供体，提高供体质量、减轻移植肾早期损伤，从而取得临床上较好的肾移植疗效。第一部分体外部分促红素衍生肽ARA290对内皮细胞低温缺氧复氧损伤中的保护作用及NF-κB的机制研究目的观察ARA290对人脐静脉内皮细胞（Humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC）低温缺氧复氧损伤中的保护作用，探讨ARA290预处理内皮细胞保护作用的NF-κB机制。方法1.建立HUVEC细胞低温缺氧复氧模型；并随机分为四组:①对照组（Control）：10%FBS的RPMI1640培养液原代培养72小时后，更换不含血清的1640培养液继续培养10小时；②缺氧/复氧组（H/R）：10%FBS的RPMI1640培养液原代培养72小时后，更换不含血清的1640培养液低温缺氧保存6h/复氧4小时；③ARA290组：10%FBS的RPMI1640培养液原代培养72小时后，更换经含10nmol/ml的ARA290的UW器官保存液；④UW器官保存液组（UW）：10%FBS的RPMI1640培养液原代培养72小时后，更换UW器官保存液并低温缺氧保存6h/复氧4小时。2.MTT比色法检测细胞活力、AnnxeniV/FITC,PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡。3.用RT-PCR技术测定内皮细胞VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、IL-6和MCP-1的mRNA表达。4.用EMSA方法测定各组低温缺氧/复氧损伤后HUVEC细胞NF-κB结合活性。结果1.Control组的细胞存活率为97.3±6.8%，而经低温缺氧复氧损伤后的H/R组细胞存活率明显下降，只有71.4±5.9%，和control组比较（P<0.01)；而经ARA290预处理组的内皮细胞存活率略低于control组，存活率为89.5±7.1%（P<0.05)，有统计学差异，而显著高于UW组和H/R组(P<0.01)，统计学有显著差异。UW组内皮细胞存活率为76.3±6.0%与H/R组无差异(P>0.05)。2.细胞凋亡率H/R组13.13±0.94%、control组1.15±0.18%、ARA290组5.34±0.61%、UW组的11.45±0.71%，ARA290预处理组的细胞凋亡率，和其余三组比较有统计学差异（P<0.05）。3.RT-PCR结果显示，经ARA290预处理组ICAM-1、VCAM-1、IL-6、MCP-1及P-selectin的mRNA表达与H/R组相比明显下降，分别下降了（65.19±3.18）%、（71.53±5.13）%、（68.53±4.81）%、（51.09±4.17）%、（45.24±3.79）%，差异有显著意义（P<0.01），而UW组各组内皮细胞的因子mRNA表达未被抑制，略低于H/R组因子的mRNA表达，两组间比较统计学无差异（P>0.05）；H/R组上述因子mRNA表达与Control组相比，分别上升了（10.58±1.17）倍、（22.03±3.74）倍、（13.29±1.87）倍、（29.13±3.15）倍、（19.15±2.18）倍，统计学上具有显著差异（P<0.01）。4.NF-κBDNA结合活性EMSA法结果显示：Control组有较弱的表达，RDU为1.20±0.11；H/R组RDU为58.31±5.17，与control组及ARA290组比较有显著差异（(P<0.01)。ARA290预处理组的RDU为8.69±1.14，明显低于UW组的RDU约为50.61±3.73，统计学上有显著差异(P<0.01)。同时在特异性竞争实验即在H/R组中，加入未标记的特异性探针及未标记非特异性探针SP-1竞争，其RDU值分别为1.55±0.23和54.3±1.60。结论1.在低温缺氧复氧损伤中，HUVEC上调了相关的趋化因子及粘附分子的mRNA表达水平。2.促红素衍生肽ARA290可对HUVEC细胞的低温缺氧复氧损伤有保护作用，可抑制其凋亡，降低了粘附分子及趋化因子的mRNA表达水平。3.促红素衍生肽ARA290预处理可抑制NF-κB的活化。第二部分在体研究促红素衍生肽ARA290减轻大鼠移植肾早期损伤及机制研究目的探讨应用促红素衍生肽ARA290预处理肾移植供体，提高供体质量、减轻大鼠移植肾早期损伤。方法1.建立大鼠异体肾移植模型，将促红素衍生肽ARA290加入UW器官保存液中对供体器官进行预处理，将大鼠随机分为3组：每组6只：（1）Sham组（假手术组），SD大鼠开腹后，即将伤口缝合，24h后切取左肾；（2）UW组，供肾经UW灌注及低温缺氧保存6h，移植到受体大鼠24h后切取移植肾；（3）ARA290组供肾经含10nmol/Kg的UW低温缺氧保存6h,移植到受体大鼠24h后切取移植肾。2.观察ARA290对移植大鼠肾功能及肾组织形态学的保护作用。3.应用免疫组织化学法观察炎性细胞对移植肾早期的浸润，并观察ARA290对其影响。4.应用分子生物学方法RT-PCR等方法检测移植术后移植肾组织炎性因子ICAM-1、VCAM-1、MCP-1及RANTES的mRNA表达，并观察ARA290对其影响。5应用EMSA法检测NF-κB的DNA结合活性，探讨其保护移植肾早期损伤的可能机制。结果：1.ARA290组的血肌酐值为180.28±32.06μmmol/L，而UW组的为319.48±35.02μmmol/L（P<0.01），Sham组的为32.15±7.08μmmol/L，而ARA组则明显低于UW组（P<0.01）；同样，ARA290组尿素氮水平明显低于UW组(19.48±3.81vs.31.19±9.17mmol/L，P<0.01)，而UW组则明显高于Sham组(31.19±9.17vs.4.21±0.69mmol/L，P<0.01)2.UW组的移植肾组织受损严重，其主要表现为肾小管结构破坏消失，上皮细胞肿胀、脱落、刷状缘丢失，可见核固缩，肾小管扩张、管腔阻塞，并伴有炎性细胞浸润；经ARA290预处理供体肾脏后，与UW组相比，移植肾的损伤程度则有明显改善；3.UW组可见大量的巨噬细胞在肾小血管间质浸润；而与ARA290组相比，经ARA290处理组则在小管间质区域偶见巨噬细胞，减少了的浸润。4.与Sham组相比，UW组移植肾的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、及RANTES的mRNA水平明显升高（P<0.05）；与UW组和相比，经ARA290处理的移植肾MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、及RANTES的mRNA水平显著下降（P<0.01）。5.ARA290组NF-κB的DNA结合活性略高于Sham组（1.016±0.28VS0.54±0.30），差异无统计学意义（P>0.05），与UW组相比（51.35±3.18VS1.16±0.38），显著抑制（P<0.01）。结论：1.促红素衍生肽ARA290对大鼠移植肾具有保护作用，可显著减轻移植肾早期的巨噬细胞在肾小管、间质的浸润，减轻形态学损伤。2.促红素衍生肽ARA290可显著抑制移植肾早期炎性因子mRNA的表达水平。3.ARA290通过抑制NF-κB的DNA结合活性，实现其对移植肾早期的保护作用。
【作者】张宏涛；
【导师】乔保平；
【作者基本信息】郑州大学，外科学，2014，博士
【关键词】ARA290；低温缺氧／复氧；HUVEC；粘附分子；趋化因子；NF-κB；大鼠；肾移植；

【参考文献】
[1]韩继东.HLJ省电力有限公司采购风险管理研究[D].吉林大学,项目管理,2014,硕士.
[2]王文志.高等医科院校附属医院发展战略研究[D].吉林大学,项目管理,2013,硕士.
[3]时颂.切花菊悬浮细胞培养与再生体系建立研究[D].北京林业大学,园林植物与观赏园艺,2013,硕士.
[4]向俊莲,王丽珍.PUBLIC在云南气象预报中的应用[J].云南大学学报(自然科学版),2001,01:16-19.
[5]关锌.地热资源经济评价方法与应用研究[D].中国地质大学,资源产业经济,2014,博士.
[6]周利军,吴广宁,唐平,王洪亮,宿冲.用于绝缘油中气体监测的半导体气敏传感器模型[J].电力系统自动化,2006,10:75-79.
[7]李玉华,卢正鼎,孙小林,李瑞轩.基于隐私保护的语义数据集成[J].华中科技大学学报(自然科学版),2005,S1:128-130+134.
[8]秦晓燕.柠檬油素的荧光性质与几种中药材的荧光分析方法研究[D].河北师范大学,分析化学,2012,硕士.
[9]邱超.磁悬浮永磁直线电动机悬浮系统模糊PID控制的研究[D].沈阳工业大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[10]史诗.媒介与权力视角下的网络集合行为[D].复旦大学,新闻学,2012,硕士.
[11]林潇琪.976例少数民族中学生学习压力问卷编制及相关研究[D].贵州师范大学,应用心理学,2014,硕士.
[12]相里微.大功率激光波前测量系统设计[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[13]余喜梅.开放式管理的应用研究[D].武汉理工大学,2004.
[14]陈威.连杖微乳的制备工艺及评价[D].广州中医药大学,中药学,2013,硕士.
[15]宫涛.变风量空调系统中最小总送风量控制的研究[D].西安建筑科技大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[16]王蕊.环形配电系统背景谐波抑制方案研究[D].燕山大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[17]岳晓.中科院寒旱所员工绩效考核体系改进研究[D].兰州大学,工商管理,2012,硕士.
[18]曾文甫.环氧树脂基纳米复合材料的制备及其力学性能研究[D].湘潭大学,2014.
[19]徐慰珠.计算机在铁合金电炉上的应用(综述)[J].冶金自动化,1982,01:47-52.
[20]邵文韬.金融体制改革视角下我国存款保险制度的构建[D].长安大学,经济法学,2013,硕士.
[21]吴丹.股权结构对上市公司社会责任履行情况的影响[D].兰州商学院,会计学,2013,硕士.
[22]彭青.当前信用体制条件下，招商银行针对中小企业融资业务的“二次转型”方案[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[23]陈占军.中职计算机实验教学管理系统开发与应用[D].山西师范大学,现代教育技术（专业学位）,2013,硕士.
[24]张艳蓉.多孔二氧化硅薄膜的制备及性能研究[D].浙江大学,材料科学与工程,2014,硕士.
[25]霍凯宇.现代有轨电车项目建设可行性及技术方案研究[D].西南交通大学,建筑与土木工程,2014,硕士.
[26]武秀杰.高学历人口婚恋观的对比研究[D].浙江大学,2009.
[27]高明久.问与答[J].冶金自动化,1988,04:63.
[28]牛成林,于希宁,李建强.专家系统在电力预测负荷中的应用[J].仪器仪表用户,2005,04:67-68.
[29]崔义真.中国与韩国文化贸易发展比较研究[D].黑龙江大学,国际贸易学,2013,硕士.
[30]任春林.Pr_(1-x)Ca_xMnO_3钙钛矿结构陶瓷磁电输运性质研究[D].湖北大学,凝聚态物理,2011,硕士.
[31]黄慧娟,禹晶,肖创柏,孙卫东.基于局部连续性与全局相似性的光谱保持型亚像元映射[J].自动化学报,2014,08:1612-1622.
[32]李慧勇.他拉哈—常家围子地区葡萄花油层层序地层学研究[D].大庆石油学院,矿产普查与勘探,2004,硕士.
[33]邱占芝,张庆灵.具有数据包丢失的奇异网络控制系统指数稳定性[J].控制与决策,2009,06:837-842.
[34]朱晶.抗支糖浆对MP引起的咳嗽变异性哮喘血清TNF-α、IL-6和IL-8水平影响研究[D].黑龙江中医药大学,中医儿科（专业学位）,2013,硕士.
[35]符皓.新世纪云南题材电影研究[D].南京师范大学,电影学,2012,硕士.
[36]钟波,肖智,周家启.基于粗糙集理论的相关关系预测方法研究[J].运筹与管理,2002,06:20-26.
[37]张庶萍,张世英.基于微分对策的供应链合作广告决策研究[J].控制与决策,2006,02:153-157+162.
[38]赵焱.信息化对党的作风建设的影响及对策研究[D].湖南师范大学,中共党史,2014,硕士.
[39]王丽.人参中强心活性部位的筛选[D].吉林农业大学,生药学,2012,硕士.
[40]黄玉吉.褐飞虱体内Himetobi P病毒的组织定位及其生理功能的初步研究[D].云南农业大学,农业昆虫与害虫防治,2013,硕士.
[41]李英.日本的ADR制度及其对我国的启示[D].中国政法大学,法学理论,2014,硕士.
[42]陈永林.民间借贷利率的司法问题研究[D].南京大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[43]应晨,阮川芬,汤逸飞,章华伟.内生产酶溶杆菌R-2-1发酵工艺优化[J].浙江农业学报,2015,02:220-228.
[44]林平.用于ICF研究的激光脉冲整形驱动的智能控制研究[D].中国科学院研究生院（西安光学精密机械研究所）,物理电子学,2013,硕士.
[45]赵雷廷.地铁牵引电传动系统关键控制技术及性能优化研究[D].北京交通大学,电力电子与电力传动,2014,博士.
[46]方真1,2,李丁3,沈春修1,2,夏玉梅2,曹孟良1,2.水稻叶绿体TALEN载体的构建及在大肠杆菌中的表达[J].杂交水稻.
[47]徐振国.基于FPGA的合成孔径雷达回波模拟器控制器的设计[D].哈尔滨理工大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[48]马蓉.甘肃省国有上市公司高管薪酬治理研究[D].兰州商学院,会计学,2013,硕士.
[49]孙岩.译者的“导演”角色[D].首都师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[50]汪倩.网上购物合同的法律规制研究[D].安徽大学,民商法学,2013,硕士.