内源性大麻素受体CB2介导抗心室重塑效应及机制研究

【摘要】慢性心力衰竭（CHF）简称心衰，是各种心脏疾病的最终结局和主要死因，而冠心病尤其是心肌梗塞是造成心衰的主要病因，在心衰的病程中，很多因素参与了其发生发展，如rass激活，氧化应激，心室重塑等，各种因素互为因果，病理生理机制错综复杂，近年发现大麻素系统也参与了心衰的发病过程，大麻素包括外源性和内源性大麻素系统（EC），EC的配体主要有：内源性花生四烯酸乙醇胺（AEA）和2-花生四烯酸甘油（2-AG），EC的受体主要有：CB1及CB2。研究显示，终末期心衰AEA及2-AG水平均显著升高；CB1略有下调而CB2显著上调，但其在心衰中的作用及机制不明。目前对心室重塑的评价尚缺乏理想的指标，可通过基因水平检测调亡基因或抗调亡基因的表达评估细胞层面的心肌重塑，通过检测心肌胶原蛋白的含量评估基质层面的心室重塑，脯氨酸是一种非必须氨基酸，在体内绝大部分存在于胶原纤维中，且在不同型别胶原中占总蛋白量比例恒定，测定组织中羟脯氨酸含量可反映胶原纤维含量；检测心肌组织Caspase-3，bcl-2，p65的表达。研究通过结扎大鼠冠状动脉，复制心肌梗塞心衰模型，研究心衰严重程度与EC的关系，及ec激活对心衰和心室重构的影响。第一章内源性大麻素系统在不同程度心力衰竭大鼠中的变化目的：本章通过复制大鼠心衰模型，4周后观察不同程度心力衰竭大鼠血清AEA、2-AG水平及心肌组织CB1与CB2表达与心功能及胶原生成的关系。方法：SPF级健康成年SD大鼠100只，通过冠状动脉结扎术,制作心肌梗死模型。冠脉结扎术后4周，再次以同样方法麻醉大鼠，固定于手术台，M型超声测定EF及左室内径。测定结束后，处死全部大鼠,腹主动脉取血4～5毫升，-80℃保存，以备检测。快速取出心脏，在液氮速冻后保存于-80℃冰箱，备用。测定BNP含量（ELISA）；用超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒测定鼠血清SOD活性和MDA含量；AEA及2AG测定（高效液相色谱法）；心肌组织胶原含量检测（氯胺T法）；Masson胶原纤维染色；RT-PCR方法检测目的基因相对表达量；蛋白印迹法(WestemBlot)检测心肌组织CB1和CB2蛋白表达；应用SPSS13.0软件医学统计软件包进行数据资料的统计学处理。结果：制作心肌梗死模型术4周末存活55只，以BNP第一分位数（P25）及第三分位数（P75）将所有心力衰竭大鼠平均分为3组分别标注为Group1；Group2；Group3，组间比较差异显著。研究发现内源性大麻素组分与心力衰竭的严重程度相关，随心衰加重血清AEA、2-AG水平显著升高；CB2显著上调；轻中度心衰CB1变化不明显，重度心衰CB1显著上调，说明在心衰的自然病程中，CB1处于低表达状态，而终末期心衰CB1显著上调。提示主要是CB2而不是CB1介导了心衰的病理生理过程。随心衰加重AEA、2-AG水平升高，心室胶原含量显著升高，反映氧化应激状态及炎症反应指标均呈明显正相关关系。结论：内源性大麻素水平与心功能相关，随着心衰加重，血清内源性大麻素水平递增，心肌胶原含量增多，同时发现内源性大麻素水平与氧化应激相关，随着内源性大麻素水平的升高，氧化应激指标丙二醛显著升高，随着心衰的加重，大麻素受体CB2表达的增加，丙二醛升高，呈正相关，而大麻素受体CB2的表达在轻中度心衰变化不明显，严重心衰状态下也显著升高。表明内源性大麻素系统参与了心衰的发病过程，但无法确定这种变化在CHF中发挥的是有益抑或有害的作用，因此有必要进一步探讨CB2激活对心衰的作用及机制。第二章大麻素受体CB2激动剂对心力衰竭大鼠氧化应激与细胞凋亡的影响目的：本章通过复制大鼠心衰模型，并以CB2受体激动剂JWH015激活CB2受体，或改变CB2受体的表达水平进行干预，4周后观察其对动物心功能、氧化应激和细胞凋亡的影响方法：同时通过复制大鼠心力衰竭模型，基因克隆、腺病毒制备和注射；超声下监测大鼠心功能；以JHW015激活CB2受体，或于蛋白水平改变受体表达水平，将AEA、2-AG水平，CB1及CB2表达量与MDA含量和SOD活性作一相关分析。观察CB2受体激动在心力衰竭中的作用，及其与氧化应激、细胞凋亡的关系。结果：Pearson相关分析结果显示，AEA及2-AG水平与MDA呈正相关，与SOD活性呈负相关；CB2亦显示出类似改变。激动CB2受体或过表达CB2受体均可缓解心力衰竭；同时减轻氧化应激、抑制凋亡促进蛋白Caspase3活性，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达；CB2受体活化，可显著抑制NK-κB中的活性成份，p65亚基。结论：1.内源性大麻素组分与心力衰竭的严重程度相关，随心衰的加重，血清AEA及2-AG水平显著，心肌组织CB2表达显著上调，而CB1表达在轻中度心衰中变化不明显，重度心衰中也显著升高，说明在心衰的自然病程中，CB1可能处于低激活状态；2.随着AEA、2-AG水平的升高和CB2表达的上调，心肌胶原含量增加。3.CB2受体上调可改善心功能及抑制心室重塑，对心力衰竭有益，其机制可能与其抗氧化应激，减少凋亡相关蛋白活化及抑制NF-κB的活性及表达有关。第三章心肌细胞CB2受体激动抑制NF-κB活性并减轻氧化应激损伤目的：研究CB2受体与及NF-κB信号通路主要执行者p65表达及活性的关系，进一步探讨CB2受体激动对心肌细胞保护作用的分子机制。方法：在前述实验基础上，以心肌细胞为研究对象，采用消化酶消化法分离培养乳鼠心肌细胞，以免疫荧光染色法进行细胞纯度鉴定，蛋白印迹检测CB2受体激动后p65的表达情况，同时通过在心肌细胞中改变其不同CB2功能状态（下调、激活或抑制），电泳迁移率变化试验（EMSA）法，检测CB2受体激动后核蛋白NF-κB在细胞内的分布情况及功能状态。所有统计分析均使用GraphPad-Prism进行。正态分布计量结果以均数±标准差表示；多组间比较采用方差分析，以SNK法校正两两比较；两组间比较采用成组设计t-检验完成。结果：蛋白印迹结果显示CB2受体激动后可抑制p65表达。同时，EMSA结果显示，CB2受体激动后核蛋白与NF-κB探针序列结合能力增强，突变探针反应证实了结合序列的特异性；Super-Shift反应进一步证实核蛋白中与靶序列结合的为NF-κB。下调或抑制CB2导致NF-κB出现相反结果，进一步证实CB2受体激动具有抑制NF-κB的作用。结论：CB2受体激动可直接显著地抑制转录因子NF-κB激活，并抑制其作为转录因子的转录活性，抑制心肌细胞凋亡及减轻氧化应激，提示CB2受体可能介导大鼠心肌梗死后心力衰竭的保护机
【作者】卢长青；
【导师】张金盈；
【作者基本信息】郑州大学，内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】急性心肌梗塞；慢性心力衰竭；心室重塑；内源性大麻素；I型大麻素受体；II型大麻素受体；花生四烯酸乙醇胺；2-花生四烯酸甘油；氧化应激；细胞凋亡；核因子-κB；

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