间充质干细胞移植对实验性自身免疫性脑脊髓膜炎CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的影响

【摘要】多发性硬化（multiplesclerosis，MS）是常见的以中枢神经系统脱髓鞘为主要特征的自身免疫性疾病（autoimmunedisease，AID），患者表现为中枢神经系统炎性脱髓鞘及相应的神经系统运动障碍。实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（experimentalautoimmuneencephalomyelintis，EAE）是自身免疫性MS的模型，也被称为实验性变应性脑脊髓膜炎（experimentalallergicencephalomyelintis，EAE），其临床表现、病理特征和免疫异常等均与人类MS极其类似，故EAE常被用于研究MS病理进展机制和观察判断MS治疗方案的有效性。大量MS免疫病理研究证实髓磷脂蛋白抗原被CD4+T细胞识别，诱导自身免疫应答。免疫细胞被异常活化并迁移进入CNS，在CNS与表达自身髓磷脂蛋白抗原的细胞相互作用，通过一系列炎症因子最终导致中枢神经系统脱髓鞘病变。中枢神经系统的脱髓鞘病变与效应性T细胞过度活化、炎症细胞在CNS浸润、前炎症细胞因子和介质的产生高度相关。Th1和Th17产生的细胞因子如干扰素-γ（interferon，IFN-γ）、肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF-α）、白细胞介素-2（interleukin2，IL-2）和IL-17能加速疾病进展，甚至IFN-γ能诱导脱髓鞘和神经元损伤。Th2细胞和CD4+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcells，Treg)能抑制自身免疫反应，通过产生细胞因子IL-10、转化生长因子-β1（transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1）、IL-4限制疾病进展。有研究表明EAE小鼠Treg细胞数量和免疫抑制功能均降低，给EAE小鼠输入功能性Treg细胞能改善其病理状况。间充质干细胞（Mesenchymalstemcell，MSC）是骨髓中除造血干细胞外的成体干细胞，广泛存在于骨髓和肝脏等多种组织。MSCs具有多潜能、自我更新和潜在的多向分化能力。MSCs能分化成各种中胚层起源的组织，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。MSCs很容易获得，具有强大的潜在体外扩增能力，且免疫原性弱，因此MSC作为组织再生的种子细胞具有良好的临床应用前景。MSCs也被发现具有显著的免疫调节活性，能抑制T细胞、B细胞和NK细胞增殖，能诱导产生Tregs，也能抑制抗原提呈细胞（antigenpresentingcell，APC)成熟及其功能。上述各种研究报道表明，MSCs在治疗自身免疫病方面有潜在的应用前景，但有关机制仍不十分清楚，本研究旨在通过探讨MSCs移植对EAE小鼠体内免疫器官中Treg数量、Foxp3、IL-10、TGF-β的影响，揭示MSCs对人类自身免疫病MS治疗的机制。材料与方法1、实验动物：选择6~8周龄雌性C57BL/6J小鼠用于EAE模型制作；选择雄性C57BL/6J小鼠做为同基因MSCs移植细胞来源，选择雄性Balb/c小鼠做为异基因MSCs移植细胞来源。2、免疫原的制备：选择髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelinoligodendrogliaglycoprotein，MOG）的MOG35–55多肽（氨基酸序列为MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK）做抗原，等体积与完全弗氏佐剂（completeFreundadjuvant，CFA）充分混匀制成油包水样乳剂，即为免疫原。3、EAE模型的制作和神经功能评分：通过给C57BL/6J小鼠多点多次注射免疫原，诱导小鼠成为EAE模型。每日观察小鼠运动、饮食等，记录小鼠症状、体征、体重变化，参照Kono等的评分标准进行神经功能评分。免疫原致敏14-20d，凡评分≥1分者可作为EAE模型。4、小鼠MSCs的分离和培养：用PBS冲洗C57BL/6J和BALB/c小鼠胫、腓骨，获得骨髓细胞，溶解红细胞后，将106/ml骨髓细胞置MSC培养液5%CO237℃孵育。72h去除非粘附细胞，待贴壁细胞融合至80%~90%培养瓶壁时，用胰蛋白酶消化，洗涤后加入MSC培养液继续传代培养至10~15d。给每只实验鼠尾静脉注射细胞总数为106MSCs。MSC扩增培养液：高糖DMEM（DulbeccomodifiedEaglesmedium，Gibco产品），热灭活10%胎牛血清，50μg/mLgentamycin，2mML-glutamine，100μMnon-essentialaminoacids，10mMHEPES，55μM2-Mecaptoethanol。5、MSCs移植：将40只C57BL/6J小鼠分为4组，每组10只。A、B、C组为EAE诱导组，符合EAE神经功能评分条件。在EAE诱导后第20~22d，A组小鼠经尾静脉注射106（200μL）BALB/c小鼠MSCs（异基因MSCs移植组），B组EAE小鼠经尾静脉注射106（200μL）C57BL/6J小鼠MSCs（同基因MSCs移植组），C组EAE小鼠经尾静脉注射200μLPBS（为EAE对照组），D组小鼠为非EAE诱导的正常小鼠（正常对照组）。6、流式细胞术分析：在MSCs移植40d，处死小鼠，分别无菌获取胸腺、脾脏、淋巴结，通过机械研磨、裂解红细胞后制成单个核细胞悬液，利用反复离心法将细胞用含1%BSA和0.1%sodiumazide的PBS洗3次，加入FITC-抗小鼠CD4mAb（0.125μg/106细胞）、APC-抗小鼠CD25mAb（0.06μg/106细胞,eBioscience产品)，检测细胞膜表面CD4、CD25分子的表达，以同型抗体做对照，冰上避光孵育30min。对于细胞内存在的Foxp3检测,需要首先将细胞固定、破膜处理（用Foxp3stainingbuffer，eBioscience产品)，再用PE-抗小鼠Foxp3mAbs(0.5μg/106细胞，eBioscience)染色。染色后细胞用流式细胞仪FACSCalibur(BD)检测。7、Realtime(RT)-PCR法检测Foxp3、TGF-TGF-β1、IL-10mRNA表达：分别从MSCs移植后20d、40d、60d各组小鼠中摘取胸腺、脾脏和淋巴结，制成单细胞悬液，分别于107个胸腺细胞、脾脏细胞和淋巴结细胞中加入Trizol试剂（Invitrogen产品）提取总RNA，用RTKit（Takara产品）反转录成cDNA，用SYBRgreenIrealtimePCRKit(Takara)试剂盒进行Foxp3、TGF-TGF-β1和IL-10mRNA检测。8、CD4+CD25+调节性T细胞对CD4+CD25-效应T细胞增殖的抑制作用：采用CD4+CD25+细胞分选试剂和免疫磁珠法分选出正常小鼠CD4+CD25-T细胞，经CD3单抗和CD28单抗活化在含IL-2的培养基中，与CD4+CD25+T细胞共培养，MTT法检测细胞增殖。即：将正常对照组小鼠的CD4+CD25-细胞100μL加入到各包被孔中，每孔分别正常对照组、EAE组、异基因MSCs移植组、同基因MSCs移植组的CD4+CD25+T细胞100μL，设3个复孔，置5%CO2饱和湿度37℃培养24h。每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，继续培养4h。小心吸去培养孔中上清，每孔加入二甲亚砜100μL，反复吹打使细胞裂解，用酶标分析仪570nm记录各孔吸光度值（A值）。9、统计学分析：实验数据用均值±标准差表示，利用SPSS13.0进行统计学分析，统计结果p<0.05为有限制性差异。结果1、MSCs体外培养、增殖特征：初分离的骨髓单个核细胞在倒置显微镜下呈现为小球形，诱导培养3~4d后部分细胞贴附于培养瓶壁，形状似纺锤形，有较强折光性。培养至7~10d，绝大多数细胞贴附于瓶壁，并逐渐生长形成分散的或条索状聚集状态，细胞体积显著增大。细胞被继续传代培养，将反复传3~4代的MSCs用于细胞移植。2、MSCs移植改善EAE小鼠临床评分每日观察和记录各组小鼠EAE一般情况和神经功能评分，结果显示：EAE诱导14d，EAE组小鼠出现显著异常表现，85%EAE诱导小鼠出现神经功能评分增加，达到2分以上，部分小鼠出现尾部瘫痪、弓背，部分小鼠表现为后肢无力、甚至瘫痪，也有部分小鼠在5d内直接发展到前肢无力。异基因MSCs移植组和同基因MSCs移植组，神经功能评分显著降低，并随时间延长，神经功能评分降低更加明显，在一周内神经功能评分迅速达到最低值，MSCs移植后神经功能持续改善，维持20d以上。经统计学分析显示：异基因MSCs移植组与EAE对照组相比有显著差异，p<0.01；同基因MSCs移植组与EAE对照组相比有显著差异，p<0.01；异基因MSCs移植组与同基因MSCs移植组相比，无显著差异，p>0.05。3、MSCs移植影响EAE小鼠脾脏、淋巴结、胸腺CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量在MSCs移植20d，无菌获取胸腺、脾脏、肠系膜和腋窝淋巴结，制备单细胞悬液，用荧光标记抗体和流式细胞术分析胸腺、脾脏和淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例。结果显示：脾脏中的CD4+CD25+Foxp3+T细胞，EAE组显著低于正常对照组（p=0.032)、异基因MSCs移植组(p<0.01)和同基因MSCs移植组(p=0.018)。淋巴结中的CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例，EAE组也显著低于正常对照组、异基因MSCs移植组及同基因MSCs移植组，p值均<0.01。胸腺中的CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例，EAE组低于正常对照组（p=0.025、异基因MSCs移植组（p<0.01）及同基因MSCs移植组（p=0.036）。4、MSCs移植改变EAE小鼠胸腺、脾脏Foxp3,TGF-β1andIL-10mRNA水平分别在MSCs移植20d、40d、60d处死小鼠，摘取胸腺、脾脏、淋巴结，制备单个核细胞，从107个细胞中提取总RNA，通过RT-PCR法检测Foxp3、TGF-β1和IL-10的表达。结果显示：Foxp3、TGF-β1和IL-10mRNA在正常对照组胸腺、脾脏和淋巴结稳定表达，EAE组小鼠Foxp3mRNA低表达，并逐渐下降至60d时间点达到最低。EAE组和正常对照组相比，上述各指标均有显著差异，p<0.01。在异基因MSCs移植20d，小鼠脾脏、淋巴结和胸腺Foxp3mRNA呈现低表达，随后逐渐增高正常水平，在异基因MSCs移植60d，与EAE组相比各器官Foxp3mRNA表达均有显著差异，p<0.01。在同基因MSCs移植组，脾脏、淋巴结、胸腺Foxp3mRNA的表达结果与异基因MSCs移植组相似，与EAE组相比各项指标均有显著差异，p<0.01。脾脏、淋巴结、胸腺TGF-β1mRNA在EAE组、MSCs异基因移植组和同基因移植组均表现为低表达（MSCs移植20d时），EAE组TGF-β1mRNA持续降低，并在60d时达到最低点，与正常对照组相比有显著差异，p<0.01。异基因移植组和同基因移植组随时间延长TGF-β1mRNA水平逐渐增加至正常水平，与EAE组相比有显著差异，p<0.01。IL-10mRNA在脾脏、淋巴结和胸腺中的表达水平有相似的趋势，异基因移植组、同基因移植组与EAE组相比，均有显著差异，p<0.01。5、CD4+CD25+T细胞（Treg）对CD4+CD25-T细胞（Teff）增殖的抑制作用EAE组小鼠CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-效应T细胞增殖的抑制作用显著降低，与正常对照组相比，P<0.01;同基因MSCs移植组与异基因MSCs移植组CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-效应T细胞增殖作用显著增强，与EAE组相比有显著差异，P<0.01;同基因MSCs移植组与异基因MSCs移植组相比，无显著差异，P>0.05。结论本研究利用MOG多肽注射小鼠成功诱导了实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（EAE）小鼠模型，并通过注射骨髓间充质干细胞（MSCs）使EAE小鼠神经功能评分降低，使胸腺、脾脏和淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+T细胞百分率增加和Foxp3、TGF-β1和IL-10mRNA表达水平增加。说明MSCs移植能预防EAE进展，并可成为临床治疗MS的手段，其中MSCs移植所致CD4+CD25+Foxp3+T细胞、Foxp3、TGF-β1和IL-10在EAE小鼠免疫器官表达增加可能是MSCs移植治疗疾病的重要机制。
【作者】朱敬松；
【导师】乔保平；
【作者基本信息】郑州大学，外科学，2014，博士
【关键词】间充质干细胞；实验性自身免疫性脑脊髓膜炎；调节性T细胞；转化生长因子β1；白细胞介素-10；

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