核基质附着区MAR增强Survivin启动子驱动的双自杀基因CD/TK靶向治疗胃癌的实验研究

【摘要】世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构（TheInternationalAgencyforResearchonCancer）发表的《2014年全球癌症报告》称：2012年全球癌症患者和死亡病例都在令人不安地增加，中国新增癌症病例高居世界第一位。在肝、食道、胃和肺等4种恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位。胃癌（gastriccancer）是发生在消化系统胃黏膜上皮组织的恶性肿瘤。它是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率为25.2/10万，占全部恶性肿瘤死亡的23.2%，居各类肿瘤的首位。早期胃癌多无症状或缺乏典型的临床表现，普查的依从性差，费用较高，大部分病人发现时多已处于进展期。传统的治疗效果不理想，预后较差，术后5年生存率并不能让人满意，死亡率仍保持在较高水平。因此寻找一种有效的、新的胃癌治疗方法以提高患者的生存率尤为重要。近年来，分子生物学的发展十分迅速，DNA重组技术日益成熟，基因治疗（genetherapy）在基础研究方面已经取得了很大的进展，成为了一种新的治疗手段。目前肿瘤基因治疗包括许多策略，如基因沉默治疗、自杀基因疗法、反义基因疗法、基因替换疗法、免疫基因治疗、抑癌基因治疗、针对一些细胞因子的基因治疗、针对耐药基因的治疗、肿瘤DNA疫苗、抗端粒酶疗法等几个方面。随着基因治疗策略的不断发展和载体的开发应用，胃癌自杀基因治疗（suicidegenetherapy）有望成为一种肿瘤治疗新方法为人们所接受，更多的癌症患者将从中获益。本课题组前期研究结果表明，在survivin基因启动子的驱动下，GFP基因可在胃癌细胞SGC-7901中表达，但在正常胃上皮细胞中不表达。转染的SGC-7901细胞中有胸苷激酶（thymidinekinase,TK）/胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase,CD）（CD/TK）融合基因的表达，但在转染的正常胃上皮细胞中未见CD/TK融合基因的表达产物；转染的胃癌SGC-7901细胞对前体药物高度敏感，CD/TK双自杀基因系统比任一单自杀基因有更好的杀伤靶细胞的效果；体内接种转染SGC-7901细胞的裸鼠移植瘤实验结果表明，与任一单自杀基因相比，双自杀基因系统治疗抑制肿瘤的生长的效果更强更显著尽管自杀基因治疗目前已成功进行体内外实验研究，但是要达到理想的用于临床治疗胃癌的效果还有很大的差距，还有一些问题有待解决，比如外源基因的导入尚缺乏特异性和靶向性，载体特异性受体在肿瘤细胞中表达较低则会导致肿瘤细胞中病毒载体的表达较低等等。核基质附着区（matrixattachmentregion,MAR）是指真核生物染色质中能够与核基质（nuclearmatrix）或核骨架产生特异性结合的DNA序列，又称为核骨架附着区（scaffoldattachmentregion,SAR）。MAR序列的功能主要是参与DNA复制调控、转录调控等多种核生化过程，同时MAR可使染色质形成独立的环状结构，从而避免位置效应引起的基因沉默。鉴于MAR序列和基因表达间的这种关系，特别是它能显著地增强外源基因表达、克服位置效应、避免转基因沉默，目前作为一种顺式调控元件已应用于转基因生物工程中。目前，通过应用MAR序列增强survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因表达系统靶向治疗胃癌的研究，迄今为止国内外尚未见报道。因此，本研究中我们构建并验证了含有MAR序列的由survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因表达系统是否可以增强对胃癌细胞及裸鼠的胃癌皮下移植瘤靶向杀伤作用，结果表明MAR序列元件可以显著增强CD/TK双自杀融合基因的表达，表达产物可以选择性的抑制胃癌细胞的增殖和促进细胞凋亡，对裸鼠的胃癌皮下移植瘤具有显著的靶向杀伤作用。研究结果为胃癌的基因治疗提供重要的理论依据，为临床应用奠定实验基础。本实验研究内容共分为四部分：第一部分含有MAR的重组pMS-CD/TK双自杀基因表达载体的构建目的分别克隆Survivin启动子、CD、TK和MAR基因，构建含有MAR的由survivin启动子驱动的CD/TK双自杀基因真核重组表达载体pMS-CD/TK。方法1.CD基因全长序列克隆和分析：设计引物，以提取的细菌E.coli基因组DNA为模板，PCR扩增CD基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-CD，进行酶切鉴定和测序验证。2.TK基因全长序列克隆和分析：设计引物，以提取的细菌E.coli基因组DNA为模板，PCR扩增TK基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-TK，进行酶切鉴定和测序验证。3.Survivin启动子基因序列克隆和分析：设计引物，以提取的人Hela细胞基因组DNA为模板，PCR扩增Survivin启动子基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-Sur，进行酶切鉴定和测序验证。4.MAR序列克隆和分析：以人β珠蛋白MAR序列为参考设计引物，以提取的人Hela细胞基因组DNA为模板，PCR扩增MAR基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-MAR，进行酶切鉴定和测序验证。5.重组pMS-CD/TK真核表达载体的构建：以质粒载体pEGFP-C1为基础，依次将Survivin启动子基因亚克隆连接构建中间载体pEGFP-Sur，再与CD和TK基因连接构建中间载体pS-CD/TK，最后将MAR基因序列连接构建含有MAR的重组真核表达载体pMS-CD/TK，并进行酶切鉴定和测序验证。结果1.PCR产物经酶切及测序鉴定成功克隆Survivin启动子基因（948bp），MAR基因（787bp），CD基因（约1302bp）和TK基因（约1175bp）。2.经不同体系双酶切和测序鉴定成功构建含有MAR的重组表达载体pMS-CD/TK和不含MAR的重组表达载体pS-CD/TK。第二部分重组pMS-CD/TK表达载体转染胃癌细胞及表达分析目的重组表达载体pMS-CD/TK和pS-CD/TK分别转染胃癌SGC-7901并分析双自杀基因CD/TK在转染细胞的表达情况。方法1.采用脂质体法将构建好的重组表达载体pMS-CD/TK和pS-CD/TK分别转化人胃癌SGC-7901细胞（靶细胞）及人胃黏膜上皮细胞GES-1（对照细胞）并筛选稳定转化株。2.应用实时荧光定量PCR法（Quantitativereal-timePCR,qPCR）检测转染细胞株中CD/TK基因表达量；Westernblot法检测转染细胞中CD/TK蛋白的表达情况。结果1.通过脂质体介导方法可有效转染SGC-7901和GES-1细胞。RT-PCR结果表明，与未转染SGC-7901细胞组相比，质粒pS-CD/TK或pMS-CD/TK转染组分别扩增出一条与预期CD/TK片段大小相符的特异性条带，而在GES-1细胞各实验组中均检测到CD/TK基因的表达。2.qPCR结果显示，CD/TK基因在转染pMS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞中的相对表达量是转染pS-CD/TK质粒的7.7倍。3.Westernblot结果也表明，与未转染的SGC-7901细胞组相比，在转染pMS-CD/TK或pS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞中可检测到一条单一特异的蛋白条带。第三部分MAR增强双自杀基因CD/TK表达对胃癌细胞的体外作用实验目的观察MAR序列增强pMS-CD/TK双自杀基因表达系统对胃癌SGC-7901细胞的体外杀伤作用。方法1.SGC-7901和GES-1转染细胞中分别加入前体药物5-FC+GCV，MTT法检测前体药物对转染细胞毒性，计算细胞的存活率。2.转染pS-CD/TK或pMS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞和未转染的细胞按所设梯度比例混合，加入5-FC和GCV联合用药治疗，MTT检测细胞的存活率以观察有无旁观者效应。3.流式细胞技术进行转染细胞凋亡率的检测。结果1.MTT检测结果显示，与未转染细胞相比，5-FC和GCV联合应用可以显著降低转染pS-CD/TK或pMS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞的存活率，差异有统计学意义（P<0.01）。与转染pS-CD/TK质粒组相比，联合应用前体5-FC+GCV后转染pMS-CD/TK质粒组SGC-7901细胞的存活率降低显著，差异具有统计学意义（P<0.01）；与未转染细胞组相比，5-FC和GCV对转染的GES-1细胞存活率均无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。2.随着不断增加转染细胞的比例，细胞的存活率呈现逐渐下降趋势，而且存在明显的旁观者效应。3.在给予5-FC+GCV前药处理后，pS-CD/TK和pMS-CD/TK质粒转染组细胞凋亡率分别为17.65±1.58%、26.25±2.63%，明显高于未转染组对照细胞凋亡率（5.01±0.22%（）P<0.05），且pMS-CD/TK转染组细胞凋亡率显著高于pS-CD/TK组。第四部分MAR增强双自杀基因CD/TK表达对体内裸鼠移植瘤的作用研究目的观察含有MAR的双自杀基因CD/TK表达系统对裸鼠胃癌SGC-7901细胞移植瘤的抑制作用。方法1.胃癌细胞裸鼠移植瘤动物模型的建立：Balb/c裸鼠右前肢腋窝皮下接种5×106SGC-7901细胞，第四天原位补种一次，建立胃癌移植瘤动物模型。2.双自杀基因系统对裸鼠胃癌移植瘤模型的疗效观察：等到裸鼠移植瘤生长至直径约为0.5cm时，将小鼠随机分成3组，6只/每组：A组，空白对照组，仅用PBS处理；B组，注射重组pS-CD/TK质粒联合前药5-FC+GCV治疗组；C组，注射重组pMS-CD/TK质粒联合前药5-FC+GCV治疗组。在给药治疗后每三天测量各组小鼠的肿瘤大小，计算瘤体体积，治疗结束时用颈椎脱臼法处死动物，取瘤测瘤重，计算抑瘤率，取肿瘤组织切片行HE染色，镜检观察肿瘤组织的病理变化。3.qPCR法检测裸鼠肿瘤组织中CD/TK双自杀基因的表达结果1.成功建立胃癌细胞裸鼠移植瘤动物模型，当裸鼠成瘤直径达0.5cm后开始进行治疗。各实验组最终瘤重和抑瘤率结果为：A组：557.1±8.9mg；B组：251.7±14.2mg，63.1%；C组：118.8±10.2mg，82.6%。与对照组相比，治疗组肿瘤体积、最终瘤重和抑瘤率明显减小，差异有统计学意义(均P<0.05)。2.肿瘤组织病理学观察结果显示，与对照组相比，治疗组可见肿瘤细胞变性坏死及多发灶性出血散在分布，细胞分裂相少，伴有纤维组织增生，并可见较多的凋亡小体。3.qPCR实验结果表明，在注射转染pS-CD/TK或pMS-CD/TK质粒的移植瘤中检测到CD/TK基因的表达，且后者的表达量是前者的约2.3倍；而PBS处理对照组未检测到CD/TK基因的表达。结论1.成功构建含有MAR的由survivin启动子驱动的CD/TK双自杀基因表达载体系统pMS-CD/TK。2.重组CD/TK融合基因在胃癌细胞SGC-7901中成功表达，MAR基因在转录和蛋白水平均可明显增加CD/TK的表达量。3.双自杀CD/TK融合基因系统对胃癌SGC-7901细胞具有显著的杀伤作用且有明显的旁观者效应。4.MAR序列可通过增强CD/TK基因的表达对胃癌SGC-7901转染细胞产生明显杀伤作用。5.MAR能增强Survivin启动子驱动的双自杀基因CD/TK抑制Balb/c小鼠移植瘤生长的作用
【作者】牛颖；
【导师】李建生；
【作者基本信息】郑州大学，内科学，2014，博士
【关键词】胃癌；基因治疗；核基质附着区；自杀基因；Survivin启动子；

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