野生二粒小麦的遗传多样性及高分子量谷蛋白亚基基因的克隆与进化分析

【摘要】野生二粒小麦(TriticumdicoccoidesL.,2n=4x=28,AABB)是普通小麦(TriticumaestivumL.,2n=6x=42,AABBDD)二级基因资源库，具有丰富的遗传多样性和许多优良的有益基因。由于普通小麦的遗传背景日益趋同，对外界的适应能力急剧下降，并且我国小麦品种的综合加工品质较低。为丰富小麦的遗传背景，增强小麦的品质，亟需挖掘和利用新的基因资源。本研究以来自中东地区的110份野生二粒小麦为材料，分别利用核基因组和叶绿体基因组上的SSR标记分析其遗传多样性以及A、B基因组在普通小麦进化中的遗传分化；通过表征其面粉品质和高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）的组成差异，探讨野生二粒小麦中HMW-GS与面粉品质之间的联系；通过克隆6个野生二粒小麦Glu-1B位点上代表性的HMW-GS基因，分析HMW-GS与品质效应间的分子基础，并根据同源性HMW-GS基因序列多重比对，探讨普通小麦B基因组的进化。主要研究结果如下：1.从58对核基因组SSR标记中共筛选出43对能扩增出稳定带型且多态性好的标记，共检测出545个等位基因变异，不同SSR位点的Nei’s基因多样性指数(He)平均为0.842。SSR引物的多态性信息含量指数（PIC）平均为0.825。其中，六倍体普通小麦和四倍体小麦的平均Nei’s基因多样性指数(He)分别为0.431、0.600，而野生二粒小麦的Nei’s基因多样性指数(He)平均高达0.836。基于核基因组SSR位点计算的Nei遗传距离构建系统聚类树，110份野生二粒小麦被分成了3大类，其遗传距离在0.3534-0.3807之间，平均为0.3664。在A组中，野生二粒小麦与四倍体小麦的遗传距离为0.4209，四倍体小麦与普通小麦的遗传距离为0.7056；B组中，野生二粒小麦与四倍体小麦的遗传距离为0.4497，四倍体小麦与普通小麦的遗传距离为0.5441，表明野生二粒小麦在普通小麦进化中A、B组存在一定的分化，并且A、B基因组的进化速率也不相同。从中国春叶绿体上的24对引物中共筛选出21对能扩增出稳定带型且有多态性的引物，共检测出56个等位基因变异，不同SSR位点的Nei’s基因多样性指数(He)平均为0.279，平均多态性信息含量指数(PIC)为0.248。基于叶绿体基因组SSR位点计算的Nei遗传距离构建系统聚类树，野生二粒小麦被分成了3大类，它们之间的遗传相似系数高达0.904，野生二粒小麦居群与四倍体小麦、普通小麦的遗传距离分别为0.27和0.3504，表明野生二粒小麦与四倍体小麦、普通小麦的叶绿体基因组有较高的相似性。2.野生二粒小麦的HMW-GS组成结果显示，在Glu-A1位点上共检测到9种类型，其中1亚基类型的频率最高，并且在Glu-A1位点上还出现了在普通小麦中很少检测到的0.8、0.9、1.1和1.2亚基。在Glu-B1位点上共检测到30种亚基及组合类型，其中以13+16亚基组合频率最高，为12.8%,13+18、7+8、7+16、7+18、6+15和6+18的亚基类型出现频率也相对较高，另外，在Glu-B1位点上还有很多单个亚基的分布。结果表明：野生二粒小麦的HMW-GS组合存在丰富的等位变异类型。3.以相同条件种植下的豫麦34为对照，对供试材料的面粉品质参数（面团形成时间、面团稳定时间和弱化度）进行了比较，结果表明：大部分材料的面团形成时间和稳定时间都较短，平均形成时间为1.73分钟，平均稳定时间为1.68分钟，而弱化度较高，平均弱化度为116.6FU，表明这些材料的面粉品质较差，但也发现了一些面粉品质参数较好的材料如J129、J135和TD-20，尤其是J129的面团稳定时间为5.3分钟，比对照豫麦34还要好。表明野生二粒小麦含有可以为小麦品质育种提供有价值的种质资源。4.采用“中间片段亚克隆”的新方法克隆了6个HMW-GS的Glu-1B基因，即TD-1Bx6、TD-1Bx13、TD-1Bx14，TD-1By15、TD-1By16和TD-1By18。分别构建这6个基因的重组表达载体进行原核表达，证实所克隆的基因是1Bx6+1By18、1Bx13+1By16和1Bx14+1By15亚基的编码基因序列。分别比较这些新基因和普通小麦Glu-1B位点（1Bx7、1Bx13、1Bx14、1Bx17、1By8、1By15、1By16、1By18）的中部重复区域中发生β-转角的序列，结果显示，1Bx亚基含有的四种重复序列总数多于1By亚基，这表明HMW-GS的x-型亚基含有更多的β-转角结构，对面团加工品质的影响比y-型亚基要大。其中，TD-1Bx13亚基和1Bx13亚基含有的β-转角结构最多，TD-1Bx6亚基和TD-1Bx14亚基与1Bx14亚基含有的β-转角结构接近，但TD-1Bx14亚基只含有两个半胱氨酸，因而，TD-1Bx14亚基决定的面团烘烤品质较差。在1By亚基中，TD-1By18亚基、TD-1By16和1By15亚基亚基含有的四种重复序列较多，TD-1By15亚基和1Bx8亚基、1Bx18亚基含有的重复序列数量比较少。在亚基组合中，TD-1Bx13+TD-1By16组合含有发生β-转角的重复序列最多，TD-1Bx6+TD-1By18亚基组合与普通小麦的1Bx14+1By15亚基组合接近，表明这两个亚基组合是优质亚基组合类型，能使面团具有更好的弹性。TD-1Bx14+TD-1By15亚基组合含有发生β-转角的重复序列相对较少，并且TD-1Bx14亚基仅含有2个半胱氨酸残基，因而，由TD-1Bx14+TD-1By15亚基组合决定的面粉加工品质较差。这可以部分解释由高分子量谷蛋白亚基决定的野生二粒小麦面粉的加工品质的差异。分别利用HMW-GS的x-型亚基基因序列和y-型亚基基因序列比较了野生二粒小麦与其他山羊草属物种的亲缘关系。结果显示，野生二粒小麦首先与普通小麦B组基因序列聚在一起，并且有较高的相似系数，这表明野生二粒小麦与普通小麦B组基因序列具有更近的亲缘关系。在x-型亚基基因序列构建的系统进化树中，山羊草属中的Aegilops.speltoides和Aegilops.longissima与野生二粒小麦聚在了一起，表明这两个物种与野生二粒小麦有较近的亲缘关系，它们可能都参与了普通小麦的B组的起源。而在y-型亚基基因序列构建的系统进化树中，发现来自山羊草属的物种与野生二粒小麦序列相似性低，这意味着普通小麦B组的供体基因组在参与普通小麦进化过程中，其基因组序列发生了较大的变化，相对于HMW-GS的x-型亚基基因序列位点而言，其y-型亚基基因序列发生的序列变化更大。目前我国小麦品质育种的一个重要方向是培育优质强筋的小麦品种，除了利用含有优质亚基的节节麦作为改良普通小麦D基因组的优异种质资源外，本研究将为改良普通小麦的A、B基因组提供优异的外源种质资源，为小麦的品质育种提供理论依据。
【作者】张大乐；
【导师】李锁平；
【作者基本信息】河南大学，植物学，2014，博士
【关键词】遗传多样性；高分子量谷蛋白亚基；野生二粒小麦；基因克隆；

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