WDR62蛋白在胃癌发生中的作用及其表达与胃癌耐药和预后的相关性研究

【摘要】目的胃癌是近发病率排名第四的恶性肿瘤,接近2/3的胃癌发生在发展中国家,而其中有42%发生在中国。尽管在胃癌的诊断方法及治疗手段上已取得不少进展,但在癌症相关死亡率排名中,胃癌仍高居世界第二。化疗是目前应用于胃癌的临床治疗方案中非常重要的一个手段,对于术后残留癌细胞的清除、防止复发、改善预后等方面都具有积极作用。但是越来越多的临床证据表明,目前常用于一线治疗的多种药物及多种给药方案的总体疗效评价不甚理想,为进一步探询内在原因及探索新的治疗方案提出要求。WD重复区域62(WDR62)是最近发现的和中心体相关的基因,它有32个外显子,1个CpG岛和poly(A)尾。WDR62位于人类染色体19q13.12区,而且靠近CEBPG,GPI和UBA2基因的功能区,参与细胞循环与增殖等生物学过程。这些基因都已被证实在DNA复制及细胞周期中发挥极其重要的作用。WDR62蛋白有13个WD重复区域,在C末端有6个可以被丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化激活的位点,具有调控细胞信号通路、转录、有丝分裂和细胞凋亡的功能。当有丝分裂发生时,WDR62的内源性表达大量聚集在分裂细胞的纺锤体极,而不是在细胞核周围,提示我们WDR62在肿瘤细胞的增殖过程中发挥着关键作用,但WDR62在人类恶性肿瘤中的作用仍然未知。本研究的目的即在于明确WDR62在人类胃癌发展与预后中的作用。方法采集372例临床胃癌患者的癌组织及癌旁胃粘膜标本,分别进行苏木素伊红(HE)染色剂免疫组织化学染色。请两名有经验的病理诊断学家分别独立阅片确认胃腺癌的诊断。用实时荧光定量PCR及WesternBlotting法检测各组织标本中WDR62的表达水平。采集胃癌病例的临床病理学特征,收集随访资料,建立Cox回归模型分析WDR62表达水平、临床病理学特征与预后之间的关系。细胞培养8株人类胃癌细胞系(AGS,SGC7901,BGC-823,MGC-803,HGC-27,SGC7901/VCR,SGC7901/DDP和SGC7901/ADM),用定量RT-PCR及Westernblotting检测WDR62的表达水平。构建慢病毒质粒载体分别转染BGC-823和多重耐药株SGC7901/VCR细胞,研究沉默WDR62对细胞生殖、侵袭转移能力、细胞周期、凋亡发生、细胞活力、化疗敏感性等的影响,并检测WDR62,cyclinB,CDK1,caspase3及Akt、ERK等其他若干信号转导分子的mRNA及蛋白表达水平。分别用慢病毒LV-shRNA-ControlandLV-shRNA-WDR62转染的BGC-823和SGC7901/VCR细胞行裸鼠皮下成瘤试验,31天后,处死裸鼠,取出肿瘤测量其大小及重量,并行HE染色,IHC染色WDR62及Ki67。结果用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测372例胃癌组织标本及其癌旁胃粘膜组织标本(NT)中WDR62mRNA表达水平发现,胃癌组织中的WDR62mRNA表达水平显著高于癌旁组织(0.0065±0.0016V.S.0.0027±0.0009,p<0.001)。低分化胃癌组织的WDR62mRNA表达水平要高于高分化胃癌组织,且差异具有统计学意义(0.0058士0.0019V.S.0.0022±0.00059,p<0.001,图1B)。免疫组化染色显示,80.1%(298/372)的癌组织呈现WDR62染色阳性表现,23.9%(89/372)的癌旁组织有WDR62染色阳性表现。胃癌组织的平均IS值显著高于癌旁组织(8.3±0.8V.S.1.7±0.7,p<0.01)。胃癌病人WDR62表达水平比较高时,其预后情况要比低表达WDR62的病人差(平均生存时间：22.0±2.2月V.S.43.0±5.6月,p=0.003)。通过建立多变量的Cox比例风险模型分析表明,有3个独立预后指标影响胃癌病人的生存时间及预后,分别为癌细胞低分化水平(风险比[HR]=2.383,p=0.009),淋巴结转移(HR=1.205；p=0.012),和WDR62高表达(HR=2.365,p=0.006)。用实时荧光定量PCR与WesternBlotting法检测WDR62在胃癌细胞系中的表达水平发现,具有多重耐药(MDR)特性的细胞系WDR62mRNA与蛋白表达水平均显著高于没有耐药性的细胞系(均为p<0.01)。在耐药株中发现WDR62mRNA与蛋白表达水平增高意味着WDR62可能参与胃癌化疗抵抗的分子机制。用重组慢病毒转染BGC-823和SGC7901/VCR细胞系后,侵袭转移试验发现LV-shRNA-WDR62与LV-shRNA-Control处理后的细胞在侵袭转移能力上没有显著差异。但体外沉默WDR62可抑制细胞生长,引起胃癌细胞阻滞在G2/M期而发生凋亡,LV-shRNA-WDR62转染组细胞发生凋亡的细胞百分比要显著高于LV-shRNA-Control处理组细胞(分别为7.223%±1.225%V.S.1.576%±0.262%,5.592%±0.336%V.S.1.617%±0.262%,均为p<0.01)。沉默WDR62基因表达能显著减少细胞周期蛋白B和CDK1的表达水平,而使具有诱导凋亡作用的caspase-3表达增高。活体内沉默WDR62可抑制胃癌细胞生长,LV-shRNA-WDR62-BGC-823组肿瘤平均大小明显小于LV-shRNA-Control-BGC-823组,差异具有统计学意义(1.62±0.17cm3V.S.3.87±0.36cm3,p<0.01).与此同时,慢病毒转染的SGC7901/VCR细胞,LV-shRNA-WDR62组肿瘤平均大小也显著小于LV-shRNA-Control组(1.52±0.12cm3V.S.3.96士0.29cm3,p<0.01).由于LV-shRNA-WDR62组WDR62表达水平受到显著抑制,Ki-67表达水平也随之下降,从而导致胃癌细胞在裸鼠体内的增殖速度明显减慢。沉默WDR62基因可部分逆转胃癌细胞对化疗药物的抵抗。WDR62通过激活并调控Akt/p38-MAPK信号通路参与调控WDR62介导的胃癌细胞多重耐药性。结论WDR62在胃癌组织中过表达,且与低分化程度及不良预后密切相关。WDR62能将胃癌细胞阻滞在G2/M期,参与调控细胞周期与增殖。沉默WDR62基因能抑制Akt,p38-MAPK和MDR1的表达与磷酸化激活,从而部分扭转胃癌多重耐药性表型。因此,WDR62是胃癌预后的新指标,有望成为提高胃癌患者化疗疗效的潜在新靶点。
【作者】曾珊；
【导师】钟美佐；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】胃癌；WDR62；预后；化疗耐药；细胞周期；

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