LSD1对结肠癌侵袭转移能力的影响及其机制的研究

【摘要】背景：结肠癌的发病率整体呈上升趋势,目前已经成为第三常见的恶性肿瘤,死亡率居世界第四位,转移是导致死亡的主要原因。上皮间质转化(epithelialmesenchymaltransition,EMT)被认为在癌症转移的起始中发挥重要作用,在此过程中,上皮细胞获得成纤维细胞样特性,细胞极性消失,细胞间粘附作用减退,侵袭和运动能力增强。转录因子snail(snail、slug、twist、zebl和zeb2等能够诱导EMT的发生,促进肿瘤的转移。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(lysine-specificdemethylase1,LSD1)在转录因子Snail/Slug介导的上皮间质转化过程中不可或缺,没有LSD1的参与,Snail/Slug将不能有效抑制E钙黏蛋白的表达。LSD1是第一个被发现的组蛋白特异性去甲基化酶,从酵母到哺乳动物都十分保守,它能特异性地去除组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)和组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)的二甲基和一甲基修饰,通过组蛋白修饰途径影响靶基因的表达。研究发现过表达LSD1能促进前列腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,但其与结肠癌的转移是否相关尚待检验。目的：在组织和细胞水平探讨LSD1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白的表达与结肠癌侵袭转移的相关性；通过RNAi技术和单胺氧化酶抑制剂在体外抑制LSD1的表达,观测其对结肠癌增殖、侵袭、凋亡的影响及E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白表达的影响；最后通过染色质免疫共沉淀技术探测LSD1影响结肠癌转移的分子机制。方法：1、利用免疫组化技术检测108例结肠癌组织中LSD1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白的表达情况,并分析其与结肠癌临床病理特征之间的关系。2、利用Transwell体外细胞侵袭实验检测结肠癌细胞株Lovo、SW620、HT-29、HCT-8、HCT-116和对照细胞(HEK293)的侵袭性,再利用Real-timeRT-PCR和Western-bloting实验方法检测LSD1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白在上述细胞中的表达,分析其与结肠癌细胞侵袭性的相关性。3、利用RNAi技术和单胺氧化酶抑制剂在体外抑制结肠癌细胞(SW620)中LSD1的表达,采用MTT细胞增殖实验、Transwell细胞侵袭实验、FCM细胞凋亡实验检测抑制LSD1的表达对结肠癌细胞SW620增殖、侵袭、凋亡的影响。4、利用染色质免疫共沉淀技术检测LSD1与SW620细胞、靶向沉默了LSD1基因或Tranylcypromine干预的SW620细胞中E钙黏蛋白启动子区域的结合丰度,并用WesternBlotting检测两者E钙黏蛋白启动子区域组蛋白H3K4me2水平。结果：1、LSD1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白在108例结肠癌组织中的阳性表达分别为72例(66.7%),92例(85.2%)和45例(41.7%),差异有统计学意义(χ2=45.00,P<0.05)。LSD1在较晚TNM分期、远处转移的结肠癌组织中的表达率明显增高(P<0.05),而E-钙黏蛋白的表达率则明显降低(P<0.05),在各项临床病理特征间N-钙黏蛋白的表达差异均无统计学意义(均P>0.05)。LSD1与E-钙黏蛋白在结肠癌中的表达呈负相关(rs=-0.318,P=0.001),与N-钙黏蛋白的表达无明显关联(rs=0.182,P=0.06)。结肠癌组织中LSD1的阳性表达和E-钙黏蛋白的阴性表达往往伴随着更低的总体生存率。2、SW620细胞中LSD1和N钙黏蛋白mRNA和蛋白水平明显高于其它四种结肠癌细胞和正常对照细胞(F=149.594,P<0.05;F=367.29,P<0.05),而E钙黏蛋白mRNA和蛋白水平明显低于其它四种结肠癌细胞和正常对照细胞(F=51.23,P<0.05)。Transwell细胞侵袭实验显示SW620细胞的侵袭性明显高于其它四种结肠癌细胞和和正常对照细胞(F=300.15,P<0.05)。相关性分析显示LSD1、N钙黏蛋白的表达与结肠癌的侵袭性呈正相关,E钙黏蛋白的表达与结肠癌的侵袭性呈负相关。3、体外合成了三段siRNA序列(siRNA-1554、siRNA-705、siRNA-1973),经检测siRNA-705的沉默效率最高。利用siRNA-705和Tranylcypromine体外干预SW620细胞,能明显抑制SW620细胞的增殖、侵袭和转移能力,并能诱导细胞凋亡。同时我们发现,使用siRNA-705和Tranylcypromine处理72小时后,结肠癌细胞的E钙黏蛋白的表达水平明显上调,N钙黏蛋白的表达水平明显下调(P<0.05)。有趣的是,siRNA-705能下调结肠癌细胞中LSD1的表达水平,而Tranylcypromine并无此功效。4、LSD1能与结肠癌细胞E钙黏蛋白启动子区域直接结合。相比于SW620细胞,靶向沉默了LSD1基因的SW620细胞中LSD1与E钙黏蛋白启动子区域的结合丰度明显降低(t=13.8,P<0.05),而Tranylcypromine的干预则不能使该结合丰度发生明显变化(t=0.623,P>0.05)。进一步研究发现,靶向沉默LSD1基因或Tranylcypromine干预都能使SW620细胞中E-cadherin启动子区域H3K4me2的水平明显增高(F=48.5,P<0.05),而两者之间E-cadherin启动子区域H3K4me2的水平无明显差异(t=0.911,P>0.05)。结论：1、在较晚TNM分期及远处转移的结肠癌组织中LSD1的表达率明显增高,而E-钙黏蛋白的表达率则明显降低,二者的表达呈负相关,与结肠癌的转移有密切关系。阳性表达LSD1和阴性表达E-钙黏蛋白的结肠癌往往预示着更差的预后。2、LSD1、N钙黏蛋白的表达与结肠癌细胞的侵袭性呈正相关,E钙黏蛋白的表达与结肠癌细胞的侵袭性呈负相关。3、体外抑制LSD1的表达能抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭转移能力,诱导细胞凋亡,并能上调E钙黏蛋白的表达,下调N钙黏蛋白的表达。4、LSD1能直接作用于结肠癌细胞E-cadherin的启动子区域。转染LSD1-siRNA能下调结肠癌细胞中LSD1与E-cadherin启动子区域的结合丰度,而单胺氧化酶抑制剂Tranylcypromine则能抑制LSD1的组蛋白去甲基化酶活性,二者都能使E-cadherin启动子区域的H3K4me2水平升高,从而上调结肠癌细胞中E-cadherin的表达,抑制结肠癌细胞转移。
【作者】丁杰；
【导师】廖国庆；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1；E-钙黏蛋白；N-钙黏蛋白；结肠癌；转移；

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