全基因组测序与病毒捕获测序技术探讨EB病毒进化及整合规律的初步研究

【摘要】Epstein-Barr病毒(EBV)是一种普遍存在的人类疱疹病毒。EBV的基因组全长约为171Kb,包含至少86个开放性阅读框。世界上大约90%的人口感染过EBV。EBV已经被证实是淋巴瘤、鼻咽癌等多种恶性疾病重要的致病因子。EBV可以感染进入宿主细胞后编码病毒蛋白,病毒蛋白可通过激活宿主细胞基因组原瘤基因表达、调节细胞周期蛋白,抑制细胞凋亡等不同机制作用于细胞,导致细胞恶性转化及肿瘤形成。同时,EBV也可以整合进入宿主细胞基因组,引起宿主细胞基因组不稳定性,并引起宿主细胞内与一些癌基因和抑癌基因的异常表达。尽管EBV整合进入宿主细胞基因组已有报道,但是由于缺乏客观、高效的研究技术去观察EBV在宿主细胞全基因组的整合,目前我们对EBV的整合以及整合对宿主细胞基因组的影响还了解甚少。Raji细胞和C666-1细胞分别是EBV阳性的淋巴瘤细胞系和鼻咽癌细胞系,它们是被全世界广范使用的用来研究EBV和宿主相互作用的经典细胞系。目前已经有超过3000篇相关文献使用了这2株细胞。另外,在Raji细胞中已经有少量的整合位点通过传统的实验技术如基因组文库构建、原位免疫荧光等被发现。为了观察EBV在肿瘤细胞全基因组的整合以及整合对癌细胞的影响,本课题采用新一代测序技术,对Raji细胞和C666-1细胞进行了高深度的全基因组测序。经过生物信息学对测序结果进行分析,我们在这两个细胞系中一共找到了909个整合位点,其中350个整合位点来自C666-1细胞系,559个来自Raji细胞系。进一步分析发现,EBV整合位点基本覆盖了整个Raji和C666-1细胞基因组,另外,我们发现,EBV整合位点也基本覆盖了2个细胞系中EBV基因组的绝大部分区域。为进一步了解EBV的整合对宿主细胞全基因组的影响,我们对C666-1细胞系和Raji细胞系的基因组进行了分析。通过将这两株细胞系基因组数据与人类参考基因组Hg19进行比对,我们在C666-1细胞系中一共发现了2,582,026个单核苷酸多态性SNPs,1038097个插入和缺失(insertionanddeletion,InDels),5820个结构变异(structuralvariations,SVs)和1510个拷贝数变异(copynumberstructuralvariationsCNVs),;在Raji细胞系中发现了2,805,619个SNPs,542732个InDels,6996个SVs和426个CNVs。进一步统计发现,超过70%的整合位点位于或者靠近细胞系SV和CNV的区域。这提示EBV可能倾向整合宿主细胞基因组不稳定的区域,而EBV的整合进一步加剧的宿主细胞基因组的不稳定性,宿主细胞基因组的不稳定性持续升高不断最终导致宿主细胞癌变。同时,我们组装并获得了Raji细胞系和C666-1细胞系中的EBV全基因组序列,并将两个细胞系中的EBV基因组序列上传到了日本DNA数据库数据库(DNADatabaseBankofJapan,DDBJ)。我们将组装出来的EBV基因组和已知的EBV基因组序列进行了进化分析,发现Raji细胞系中的.EBV基因组序列和几个重要的病毒基因序列与其他淋巴细胞起源的EBV基因组更具亲缘性,而C666-1细胞系中的EBV基因组则与鼻咽细胞起源的EBV基因组亚型更类似。这提示EBV基因组表型可能与疾病表型相关。由于全基因组测序技术目前仍十分昂贵,不适合在大数量临床肿瘤样本中进行应用,所以我们使用了EBV病毒序列捕获测序方法来进一步了解EBV的整合以及鼻咽癌中EBV亚型的进化以及变异情况。我们对18例EBV相关的鼻咽癌活检组织进行了EBV病毒序列捕获测序。我们在18例鼻咽癌组织中都发现了EBV的整合。进一步数据分析发现在鼻咽癌组织中EBV更倾向整合于癌细胞染色体端粒和着丝粒区域。提示EBV可能通过在端粒和着丝粒区域的整合提高宿主细胞基因组的不稳定性从而导致宿主细胞最终癌变。同时,我们组装了18例鼻咽癌组织中的EBV基因组并将数据上传到DDBJ.通过序列进化以及比较分析,我们发现EBV基因组的变异主要集中在EBV基因组90Kb到100Kb区域(此处编码EBNA1基因,该基因与EBV基因组的复制相关)和165Kb-170Kb区域(此处编码LMP1基因,该基因是公认的致瘤病毒蛋白基因)。该结果提示EBV可能通过在编码2个重要病毒基因区域的高频变异获得更多的感染和繁殖能力。通过进化分析我们发现使用EBV基因组或者编码EBNA1的基因序列能够很好的将EBV相关的疾病类型及地域进行聚类。这提示EBV基因组和EBNA1序列可以作为潜在的EBV分型标志物以及相关疾病的分型指标。本研究工作首次利用全基因组测序技术对EBV在宿主细胞基因组的整合以及EBV基因组的进化和变异研究。Raji细胞,C666-1细胞以及18例鼻咽癌组织中的EBV基因组序列为EBV相关的研究提供了宝贵的数据资源,为研究EBV整合以及EBV亚型与肿瘤的相互关系提供了的一种新的研究模式。
【作者】喻正源；
【导师】李桂源；
【作者基本信息】中南大学，病理与病理生理学，2013，博士
【关键词】EB病毒；整合；新一代测序技术；鼻咽癌；淋巴瘤；C666-1细胞；Raji细胞；

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