IGFBP-2调控非小细胞肺癌侵袭转移和血管生成的初步研究

【摘要】第一部分IGFBP-2在非小细胞肺癌组织的表达及临床意义目的：检测胰岛素样生长因子结合蛋白-2(insulinlikegrowthfactorbindingprotein-2,IGFBP-2)在非小细胞肺癌组织中的表达并探讨其临床意义。方法：采用RT-PCR和Westernblot方法检测20例新鲜非小细胞肺癌组织和相应的癌旁肺组织IGFBP-2mRNA和IGFBP-2蛋白的表达；对1635例非小细胞肺癌术后患者进行随访,选取其中110例获得完整随访和临床资料的患者,采用免疫组化方法检测其非小细胞肺癌组织石蜡标本中IGFBP-2蛋白和微小血管密度(microvesseldensityMVD)的表达；采用Logistic多因素分析法,结合临床资料、随访资料和检测结果,分析IGFBP-2的表达与非小细胞肺癌转移和预后的关系。结果：1.在20例新鲜非小细胞肺癌标本中,65%(13/20)的非小细胞肺癌组织和30%(6/20)的癌旁肺组织可检测到IGFBP-2mRNA的表达。非小细胞肺癌组织中IGFBP-2mRNA的阳性表达率显著高于癌旁肺组织中IGFBP-2mRNA的阳性表达率(x2=4.916,P=0.027)。非小细胞肺癌组织中IGFBP-2mRNA的平均表达水平也明显高于癌旁肺组织中IGFBP-2mRNA的平均表达水平(3.17±0.50vs0.96±0.10,P<0.01)。在55%(11/20)的非小细胞肺癌组织中及20%(4/20)的癌旁肺组织中可以检测到IGFBP-2蛋白的表达,非小细胞肺癌中IGFBP-2蛋白的阳性表达率显著高于癌旁肺组织中IGFBP-2蛋白的阳性表达率(x=5.227,P=0.022)。IGFBP-2蛋白在非小细胞肺癌组织中的平均表达水平也明显高于癌旁肺组织组织中的平均表达水平(0.57±0.03vs0.23±0.04,P<0.01)。2.IGFBP-2蛋白在非小细胞肺癌阳性表达表现为程度不同棕黄或棕褐色颗粒,多数位于细胞浆内,还有部分位于细胞膜,极少数位于细胞核内。在110例的非小细胞癌组织中IGFBP-2蛋白阴性表达率为48.2%(53/110),阳性表达率为51.8%(57/110)。在57例IGFBP-2蛋白表达阳性患者中有26出现远处转移,转移发生率为45.6%,在53例IGFBP-2蛋白表达阴性患者中有11例出现远处转移,转移发生率为20.8%；在37例出现远处转移的患者中,有26例患者IGFBP-2蛋白表达阳性(阳性率70.3%),在73例未出现远处转移的患者中,有31例患者IGFBP-2蛋白表达阳性(阳性率42.5%),差异具有显著性(27.60,P<0.01)。3.Kaplan-Meier法进行生存分析发现：110例非小细胞肺癌患者平均生存时间为(72.60-4.57)月,IGFBP-2阳性组平均生存时间为(62.99±6.10)月,IGFBP-2阴性组平均生存时间为(75.65±4.42)月。Log-Rank(Mantel-Cox)计算x2=8.64,IGFBP-2阳性组患者手术后生存率低于IGFBP-2阴性组(P<0.01)。Logistic多因素回归分析,发现MVD、IGFBP-2和TMN分期是非小细胞肺癌发生侵袭转移的独立预测因子。4.110例非小细胞肺癌患者中IGFBP-2阳性组和IGFBP-2阴性组MVD数分别为(19±2)个和(8±3)个,IGFBP-2阳性组患者非小细胞肺癌石蜡标本MVD表达明显高于IGFBP-2阴性组(P<0.01)。结论：1.根据本研究结果尚不足以证实IGFBP-2是非小细胞肺癌的肿瘤标志物。2.非小细胞肺癌组织表达的IGFBP-2与非小细胞肺癌的侵袭转移和预后有关。3.非小细胞肺癌细胞表达的IGFBP-2蛋白可能通过调节非小细胞肺癌的血管生成,参与非小细胞肺癌的侵袭和转移。第二部分siRNA沉默IGFBP-2对人肺癌95D细胞VEGF表达及生物学行为的影响目的：观察应用特异性siRNA沉默IGFBP-2对人肺癌95D细胞VEGF表达及生物学行为的影响,探讨IGFBP-2调控人非小细胞肺癌侵袭转移和血管形成的分子机制。方法：1.应用化学合成法合成针对IGFBP-2的siRNA片段,使用脂质体转染法转染人肺癌95D细胞,利用倒置荧光显微镜检测转染效率,MTT法检测IGFBP-2siRN对人肺癌95D细胞毒性,RT-PCR和Westernblot方法检测人肺癌95D细胞IGFBP-2mRNA和蛋白的表达情况,筛选出沉默效果最佳的特异性siRNA片段。2.应用沉默效果最佳的特异性siRNA片段转染人肺癌95D细胞,RT-PCR和Westernblot方法检测人肺癌95D细胞VEGFmRNA和蛋白的表达情况。3.应用沉默效果最佳的特异性siRNA片段转染人肺癌95D细胞,采用细胞划痕实验、Transwell侵袭小室测定法,MTT法检测人肺癌95D细胞侵袭迁移和增殖能力的变化。结果：1.转染IGFBP-2-siRNA片段的人肺癌95D细胞培养24h后,在倒置荧光显微镜下与光镜下观察,并将荧光镜下视野与光镜下视野对比,发现细胞的转染效率达到80%以上；继续培养72h后,应用MTT法检测,发现细胞存活率均>80%。RT-PCR结果(表2-4)显示,人肺癌95D细胞转染IGFBP-2-siRNA-homo-558、IGFBP-2-siRNA-homo-923、IGFBP-2-siRNA-homo-104348h后,分别转染IGFBP-2-siRNA-homo-558、IGFBP-2-siRNA-homo-1043的C组、E组细胞IGFBP-2mRNA相对表达量(分别为3.32±1.05和4.14±1.27)与A组、B组(分别为9.14±0.35和9.02±0.88)比较差异均有统计学意义(P均<0.05),转染IGFBP-2-siRNA-homo-923的D组细胞IGFBP-2mRNA相对表达量(1.18±0.31)与A组、B组(分别为9.144±0.35和9.02±0.88)比较差异亦有显著统计学意义(均P<0.01)。而且转染IGFBP-2-siRNA-homo-923的D组细胞IGFBP-2mRNA相对表达量(1.18±0.31)较转染IGFBP-2-siRNA-homo-558的C组(3.32±1.05)和转染IGFBP-2-siRNA-homo-1043的E组(4.14±1.27)更低(P均<0.05),表现出更好的沉默IGFBP-2表达的趋势。与A组相比较C、D、E组抑制IGFBP-2表达的抑制率分别为64.89%、87.33%、55.86%,人肺癌95D细胞转染IGFBP-2-siRNA-homo-558、IGFBP-2-siRNA-homo-923.IGFBP-2-siRNA-homo-104348h后,Westernblot检测转染后细胞中IGFBP-2蛋白的表达,与A组相比较,C组(转染IGFBP-2-siRNA-homo-558)(0.135±0.0076vs0.814±0.0345,P<0.01)、D组(转染IGFBP-2-siRNA-homo-923)(0.080±0.0070vs0.814±0.0345,P<0.01)和E组(转染IGFBP-2-siRNA-homo-1043)(0.221±0.0122vs0.814+0.0345,P<0.01)均能使IGFBP-2蛋白的相对表达显著减低,其中D组(转染IGFBP-2-siRNA-homo-923)沉默效果最为显著(0.080±0.0070vs0.814±0.0345,P<0.01),B组(阴性对照组,转染阴性对照-siRNA)对IGFBP-2蛋白的表达无明显影响(0.814±0.0345vs0.799±0.0135,P>0.05)。IGFBP-2-siRNA-homo-923对人肺癌95D细胞IGFBP-2沉默效果最佳。2.将IGFBP-2-siRNA-homo-923和阴性对照siRNA片段分别转染入人肺癌95D细胞48h后,RT-PCR结果显示,A组(对照组)、B组(转染阴性对照siRNA组)与C组(转染IGFBP-2-siRNA-homo-923组)人肺癌95D细胞VEGFmRNA相对表达量分别为4.26±0.95、4.23±1.05和1.09±0.10,C组人肺癌95D细胞VEGFmRNA相对表达量明显低于A组与B组(P值均<0.01),A组人肺癌95D细胞VEGFmRNA与B组相比,无显著统计学差异(P>0.05);Westernblot结果显示,A组、B组与C组人肺癌95D细胞VEGF蛋白相对表达量分别为0.4144±0.014、0.412±0.012和0.132±0.004,C组人肺癌95D细胞VEGF蛋白相对表达量明显低于A组与B组(P值均<0.01),A组人肺癌95D细胞VEGF蛋白相对表达量与B组相比,无显著统计学差异(P>0.05)3.将IGFBP-2-siRNA-homo-923和阴性对照siRNA片段分别转染入人肺癌95D细胞24h后,A组、B组及C组24h划痕愈合率分别为(86±1.58)%、(86.44±4.28)%、(60.2±5.36)%,C组细胞迁移能力较A组及B组明显下降(P值均<0.01)；A组、B组及C组24h穿过Transwell的每低倍视野细胞数分别为42.00±4.47、42.80±5.47、20.20±4.44个,C组细胞侵袭能力较A组及B组明显下降(P值均<0.01);A组、B组及C组24h、48h、72h细胞增殖能力均无差异(P值均>0.05)。结论：1.化学合成法合成的针对IGFBP-2的特异性siRNA可以显著地下调人肺癌95D细胞IGFBP-2mRNA和蛋白的表达2.沉默IGFBP-2表达可以抑制人肺癌95D细胞VEGF的表达,细胞侵袭和运动能力,但未发现对其增殖能力有明显影响。3.IGFBP-2可能通过调控VEGF表达影响非小细胞肺癌的血管生成,从而促进非小细胞肺癌侵袭转移。第三部分沉默人肺癌95D细胞IGFBP-2表达对体外血管形成的影响目的：探讨沉默IGFBP-2表达对非小细胞肺癌血管形成的影响。方法：利用IGFBP-2-siRNA-homo-923沉默人肺癌95D细胞IGFBP-2的表达,将其培养上清液与HUVEC共培养,采用细胞划痕实验、MTT法、Matrixassays实验检测HUVEC迁移、增殖和分化成管能力。结果：A组、B组及C组24h划痕愈合率分别为(83±3.16)%、(84.2±8.17)%、(56.8±3.35)%,C组HUVEC细胞迁移能力较A组及B组明显下降(P均<0.01),A组、B组两HUVEC细胞间细胞迁移能力无明显差别(P>0.05)；在HUVEC培养的24h、48h、72h时间点,A组和B组两组HUVEC细胞MTT检测的吸光度值均无明显差异(P均>0.05),并且呈明显的上升趋势(P均<0.01)。C组HUVEC细胞在上述各个时相的吸光度值均显著低于A组和B组(P均<0.01),并且呈上升趋势(P<0.01),但上升幅度比A组和B组小；A组、B组]HUVEC细胞24h能形成完整、丰富的管腔结构,而C组HUVEC细胞24h管腔结构明显不完整并且稀少。A组、B组和C组HUVEC细胞24h能形成的管腔数分别为(18.4±2.07)个、(18.2土1.92)个和(5.0土1.58)个。A组、B组两HUVEC细胞间形成的管腔数无明显差别(P>0.05),C组HUVEC细胞形成的管腔数明显少于A组及B组(P均<0.01)。结论：1.沉默人肺癌95D细胞IGFBP-2的表达能显著抑制HUVEC的迁移、增殖和分化成管能力,抑制体外血管形成。2.IGFBP-2可能成为临床药物治疗非小细胞肺癌的新靶点。
【作者】林国强；
【导师】陈胜喜；蒋海河；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】胰岛素样生长因子结合蛋白-2；非小细胞肺癌；肿瘤标志物；转移；预后因素；RNA干扰；血管生成；血管内皮细胞生长因子；

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