颞叶癫痫大鼠海马GSK-3β的动态变化及其抑制剂在苔藓纤维出芽中的作用

【摘要】第一部分GSK-3β在戊四氮慢性点燃大鼠海马表达与活性的动态变化目的：在戊四氮慢性点燃大鼠过程中动态观察GSK-3β,P-GSK-3β(ser9),P-tau(ser396)蛋白在海马的表达变化,探讨GSK-3β在苔藓纤维出芽过程中的作用。方法：6-8周健康雄性SD大鼠,共135只,将大鼠随机分为实验组(n=90)和对照组(n=45)。实验组予以每日腹腔注射戊四氮亚惊厥剂量(30mg/kg)建立慢性点燃颞叶癫痫模型,对照组每日予以腹腔注射等量的生理盐水。根据首次腹腔注射后第3天,1周,2周,4周和6周将实验组和对照组随机分为5个亚组。每个亚组再分为三个小组,实验组每小组6只大鼠,对照组每小组3只大鼠,分别进行：(1)Timm染色观察海马苔藓纤维出芽并评分；(2)Westernblot方法检测GSK-3β,及其非活性形式P-GSK-3p(ser9)和下游磷酸化底物P-tau(ser396)三个指标在海马的总蛋白量的表达变化。(3)免疫组化方法分别检测GSK-3β、P-GSK-3β(ser9)、P-tau(ser396)在海马各区域的表达及分布变化。结果：1.实验组大鼠模型点燃成功率为94.7%,死亡率2.1%,所有达到完全点燃标准的大鼠均可见到反复自发痫性发作。对照组大鼠行为正常,始终未见痫性发作。2.对照组大鼠CA3区在各时间点均未见明显出芽,实验组大鼠CA3区在点燃过程的第3天即观察到少量苔藓纤维出芽,并呈进行性增加。与对照组相应时间点比较差异有统计学意义(P<0.05)。组内除4周组与6周组之间无统计学差异外(P>0.05),其余各时间点之间比较均有差异(P<0.05)。实验组与对照组大鼠齿状回内分子层均未见到明显的苔藓纤维出芽,两组间比较无统计学差异(P>0.05)。3.Westernblot结果显示：在戊四氮慢性点燃大鼠过程中,GSK-3β表达成升高趋势,2周时达高峰,6周时恢复至正常水平。其非活性形式P-GSK-3β(ser9)表达变化与之相反,两周时表达下调至低峰,6周时恢复至正常水平。除6周组外,实验组各时间点与对照组相比具有差异(P<0.05)。P-tau(ser396)呈升高趋势,6周时达高峰,实验组各时间点与对照组相比均有差异(P<0.05)。组内除2周组,4周组与6周组之间无统计学差异外(P>0.05),其余各时间点之间比较均有差异(P<0.05)。4.免疫组化结果显示：GSK-3β,P-GSK-3p(ser9),P-tau(ser396)的蛋白表达变化趋势与Westernblot结果一致,但每个指标在海马各区的表达变化存在差异,实验组与对照组的三个指标在CA3区的变化差异最大(P<0.05),DG区次之(P<0.05),CA1区无明显变化趋势(P>0.05)。结论：1.GSK-3β可能通过调节tau磷酸化水平参与苔藓纤维出芽的过程。2.GSK-3β在CA3区的表达及活性变化可能较DG区变化在颞叶癫痫形成过程中更为重要。第二部分干预GSK-3β对苔藓纤维出芽及颞叶癫痫的形成与发展的影响目的：探讨在大鼠慢性点燃过程中干预GSK-3β活性对tau蛋白磷酸化水平及苔藓纤维出芽的影响。方法：68周清洁级健康雄性SD大鼠,共180只,将大鼠随机分为PTZ+SB216763干预组(n=90)和PTZ+DMSO实验组(n=90)。两组大鼠均予以每日腹腔注射戊四氮亚惊厥剂量(30mg/kg)建立慢性点燃颞叶癫痫模型,同时分别在点燃过程的第2天,第4天,第6天予以干预组大鼠侧脑室注射GSK-3β的选择性抑制剂SB216763,实验组大鼠予以侧脑室注射空白对照DMSO溶剂(经生理盐水稀释)。将每组大鼠划分为3天,1周,2周,4周,6周5个亚组,每组18只大鼠,每个亚组再分为3各小组,每个小组6只大鼠,分别进行：(1)Timm染色观察两组大鼠海马苔藓纤维出芽差异；(2)Westernblot方法分别检测两组大鼠GSK-3β,P-GSK-3β(ser9)和P-tau(ser396)在海马的总蛋白量变化差异。(3)免疫组化方法进一步检测上述三个指标在海马各区域的表达及分布变化差异。结果：1.干预组大鼠经戊四氮亚惊厥剂量重复刺激出现痫性发作的时间(第8天)晚于实验组(第5天)。实验组大鼠平均点燃时间为21.4±1.8天,而干预组大鼠平均点燃时间为26.4±1.2天。干预组大鼠模型点燃成功率仅82.6%,而实验组成功率为91.4%。以上各差异均存在统计学意义(P<0.01)。干预组与实验组大鼠的死亡率分别为6.8%和7.9%,无显著差异(P>0.05)。但与第一部分实验组的死亡率2.1%相比,均存在显著差异(P<0.01)。实验组达完全点燃标准的大鼠均可观察到反复Ⅱ-Ⅳ级的自发发作,而干预组大鼠仅有50%的大鼠可观察到Ⅱ-Ⅲ级的自发发作,差异显著(P<0.01)。两组大鼠均未观察到V级自发发作或癫痫持续状态。2.实验组大鼠CA3区起始层在点燃过程的第3天就已出现轻度苔藓纤维出芽,随着给药天数逐渐增加,苔藓纤维出芽评分也逐渐升高。相比之下,干预组CA3区起始层在点燃过程的第3天仍未见到出芽,1周时仅可见到少量点状Timm染色颗粒,随着给药天数逐渐增加,苔藓纤维出芽评分的增长趋势也明显减慢,与实验组相应各时间点的差异均有统计学意义(P<0.05)。两组大鼠而在齿状回内分子层区域,仅部分大鼠可见点状Timm颗粒,两组间相应各时间点均无统计学差异(P>0.05)。3.westernblot及免疫组化结果均显示GSK-3β的总表达量在两组大鼠的表达变化趋势一致,均在3天时表达上调,2周时达高峰,4周时开始下降,除了4周干预组GSK-3β表达较实验组明显下调外(P<0.05),其余各时间点与实验组比均无显著差异(P>0.05)。与实验组相比,干预组大鼠P-GSK-3β(ser9)的表达在3天组出现显著升高(P<0.01),1周时表达开始缓慢下降,到2周时下降至最低值,4周时表达上调,6周时与实验组无显著差异,除6周组外(P>0.05),两组间各时间点比较仍存在统计学差异(P<0.05)。P-tau(ser396)在两组大鼠中的表达均呈升高趋势,但干预组各时间点的P-tau(ser396)表达量均低于实验组(P<0.05),尤其是3天组的表达量甚至低于正常的大鼠,与实验组相比存在显著差异(P<0.01)。结论：1.抑制GSK-3β的活性可延缓颞叶癫痫的形成与发展,减轻痫性发作程度。2.抑制GSK-3β的活性可能通过降低tau蛋白磷酸化水平抑制苔藓纤维出芽。第三部分干预GSK-3β对相关基因在颞叶癫痫大鼠海马的表达影响目的：观察GSK-3β及其上游调节因子PTEN,AKT1和下游底物MAPT在戊四氮慢性点燃大鼠中的基因表达变化,探讨GSK-3β信号通路在颞叶癫痫中的作用。方法：6-8周健康雄性SD大鼠,共50只,将大鼠随机分为PTZ+SB216763干预组(n=20),PTZ+DMSO实验组(n=20)和DMSO+SB216763对照组(n=10)。PTZ+SB216763干预组,PTZ+DMSO实验组予以每日腹腔注射戊四氮亚惊厥剂量(30mg/kg),DMSO+SB216763对照组每日腹腔注射等量生理盐水,根据首次腹腔注射后第3天,1周,2周,4周和6周将三组大鼠随机分为5个亚组。PTZ+DMSO实验组,PTZ+SB216763干预组每个亚组4只大鼠,DMSO+SB216763对照组每个亚组2只大鼠。分别于点燃过程的第2天,第4天,第6天分别予以干预组及对照组大鼠侧脑室注射GSK-3β的选择性抑制剂SB216763,实验组侧脑室注射DMSO溶剂(经生理盐水稀释)。采用RT-PCR方法按时间点检测各组大鼠GSK-3p及其上游调节因子PTEN,AKT1和下游底物MAPT的基因表达变化。结果：1.与DMSO+SB216763对照组相比,PTZ+DMSO实验组大鼠GSK-3β从第3天开始即出现表达上升趋势,1周时达高峰,4周时表达下调,6周时下降至正常水平,除6周组外(P>0.05),与DMSO+SB216763对照组各时间点相比均存在统计学差异(P<0.05)。PTZ+SB216763干预组与PTZ+DMSO实验组大鼠相比,其表达变化趋势一致,除4周组表达有所下调外(P<0.05),其余各时间点均无差异(P>0.05)。2.与DMSO+SB216763对照组相比,GSK-3β的上游负调控因子AKT1在PTZ+DMSO实验组大鼠3天,1周,6周时表达上调(P<0.05),2周,4周时与对照组无差异(P>0.05)。PTZ+SB216763干预组与PTZ+DMSO实验组大鼠表达趋势基本一致,除6周的表达明显下降(P<0.05)。其他各个时间点的表达均无显著差异(P>0.05)。3.PTEN为GSK-3β上游正调控因子,PTZ+DMSO实验组大鼠与DMSO+SB216763对照组大鼠相比,第3天即出现显著升高趋势,1周时上升达高峰,2周时表达下降,6周时表达低于对照组,除4周组外(P>0.05),其余各时间点均存在统计学差异(P<0.05)。PTZ+SB216763干预组与PTZ+DMSO实验组大鼠相比,各个时间点均无显著差异(P>0.05)。4.GSK-3β的下游磷酸化底物总tau蛋白MAPT在PTZ+DMSO实验组大鼠的表达与DMSO+SB216763对照组大鼠相比,第3天即出现表达上调,并进行性上升,第4周时达高峰,第6周时下降至对照组水平。除6周组外(P>0.05),其余各时间点均存在统计学差异(P<0.05)。PTZ+SB216763干预组与PTZ+DMSO实验组大鼠相比,虽仍从第3天开始呈表达上升趋势,但上升幅度明显降低,除6周组外,其余各时间点均存在统计学差异(P<0.05)。结论：1.PTEN,AKT在颞叶癫痫形成过程中的基因表达变化可能与GSK-3β信号通路相关。2.苔藓纤维出芽过程中干预GSK-3β的活性可同时影响Tau蛋白的基因表达和磷酸化水平。
【作者】黄文皎；
【导师】田发发；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】颞叶癫痫；苔藓纤维出芽；糖原合成酶激酶-3β；tau蛋白；

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