组织因子在人胚胎干细胞诱导分化过程中表达及调控的研究

【摘要】在机体的发育过程中,基因的表达受到精确的调控。这种调控使基因按照机体发育的需要,表达呈现出特异的时间和空间特异性。近年来基因与蛋白的特异性表达已经成为发育生物学中的研究热点。组织因子(Tissuefactor,TF),又称为凝血因子Ⅲ、CD142,是由263个氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白,在体内广泛表达,其在许多重要的生理及病理情况下,特别是维持机体凝血平衡和保护重要脏器方面具有重要作用。血栓与止血平衡是发育过程中最重要的稳态之一。在血细胞形成之前,由滋养层细胞(Trophoblast)表达的大量TF使胚胎稳定,在防止流产和妊娠大出血方面有重要意义。在血细胞形成后,TF在不同的血细胞中表达水平不同,其具体调控机制目前尚未明确。人胚胎干细胞(humanembryonicstemcells,hESCs)由于其维持自我干细胞特性及多向分化潜能的特性,成为我们研究基因时间和空间特异性表达的良好模型。miRNA是一类约17-24个碱基的非编码单链小分子RNA。现在已知miRNAs这些微小的RNAs控制着许多重要的生理或病理过程。而Akt和Erk1/2在包括发育、细胞增殖和肿瘤发生发展等过程中起重要作用。在本实验中我们以人类胚胎干细胞为体外模型,分化成造血细胞及滋养层细胞,检测不同分化阶段细胞中TF的表达水平的变化。并进一步探讨在分化过程中,miRNA及Erkl/2对TF表达的调控。本研究分为以下三个部分：第一部分组织因子在人胚胎干细胞分化过程中的表达变化目的建立有效的人胚胎干细胞向造血细胞及滋养层细胞诱导分化体系,为后续实验提供可靠地细胞标本。检测分化过程中不同阶段TF的表达水平。方法①将人胚胎干细胞(hESCs)诱导分化出造血干/祖细胞(hematopoieticstem/progenitorcells,HSPCs)及滋养层细胞；②将造血干/祖细胞分化为粒-单细胞及红细胞；③流式细胞学检测造血细胞特异性标记,RT-PCR检测滋养层细胞特异性标记；④磁珠分选CD34+,或CD14+,或CD15+细胞,检测TF(CD142)表达水平；⑤qPCR,RT-PCR及Westernblot检测TF的mRNA及蛋白水平的表达。结果①人胚胎干细胞(hESCs)与小鼠骨髓基质细胞(OP9)共培养第8天,流式细胞学检测CD34+细胞比例达到17.2%,磁珠分选后,流式细胞学检测TF表达为阴性；②添加不同细胞因子组合诱导粒-单细胞及红细胞,磁珠分选后检测TF表达,发现粒-单细胞TF表达呈阳性,红细胞TF表达呈阴性；③RT-PCR检测BMP4方法诱导分化第0天、第2天、第5天的滋养层细胞,培养第0天可见OCT-4、Nanog表达；培养第5天可见滋养层特异性基因CDX2表达,TF表达；④粒-单细胞和滋养层细胞TF的]mRNA和蛋白水平有表达,而人胚胎干细胞、造血干/祖细胞、红细胞TF不表达。结论我们通过有效地人胚胎干细胞向造血细胞及滋养层细胞的诱导分化体系,发现粒-单细胞和滋养层细胞的TF有表达,而人胚胎干细胞、造血干/祖细胞、红细胞不表达TF。第二部分miRNA在组织因子表达过程中的调控作用目的研究miRNA在TF表达过程中是否起调控作用。方法①检测人胚胎干细胞、造血干/祖细胞、粒-单细胞和滋养层细胞miRNA表达谱；②进一步进行生物信息学分析,确定候选miRNA为miR-19a,miR-20b,miR-106a,miR-223;③检测人胚胎干细胞、造血干/祖细胞、粒-单细胞和滋养层细胞中候选miRNA的表达；④构建正常及突变的TF-3’UTR,双荧光素酶报告基因检测TF的表达水平；⑤将miR-20b的抑制剂及TF-3’UTR转入细胞,检测其对TF表达水平的影响。结果①人胚胎干细胞、造血干/祖细胞、粒-单细胞和滋养层细胞表达谱检测差异性表达的miRNA;②使用Targetscan及miRBase软件,生物信息学分析筛选其中结构最可能与TF-3’UTR结合的miRNAs;③筛选其中表达差异最大的miR-19a,miR-20b,miR-106a,miR-223进行qPCR验证；④双荧光素酶报告基因检测发现miR-20b对TF的表达有调控作用；⑤将miR-20b的抑制剂及TF-3’UTR转入细胞,检测其对TF表达水平的影响,验证miR-20b的调控作用。结论miR-20b在转录后水平调控TF的表达,抑制miR-20b的作用可使TF的表达水平升高。第三部分Erkl/2在组织因子表达过程中所起的调控作用目的研究Erkl/2.Akt在TF表达过程中是否有调控作用。方法①检测人胚胎干细胞、造血干／祖细胞、粒-单细胞、红细胞和滋养层细胞Erkl/2和Akt的表达水平；②将Erkl/2的抑制剂,即U0126,加入粒-单细胞及滋养层细胞,qPCR和Westernblot检测细胞表面标记PU.1、CDX2及TF的mRNA和蛋白表达水平；③将U0126及miR-20b的抑制剂同时加入粒-单细胞及滋养层细胞,qPCR检测细胞表面标记及TF的mRNA表达水平。结果①检测人胚胎干细胞、造血干/祖细胞、粒-单细胞、红细胞和滋养层细胞Erkl/2和Akt,发现Erkl/2表达与TF表达相关,而Akt则没有；②将U0126加入粒-单细胞及滋养层细胞,TF的nRNA及蛋白水平均下降,而细胞表面标记没有发生变化；③将U0126及miR-20b的抑制剂同时加入粒-单细胞及滋养层细胞,qPCR检测细胞表面标记未发生变化。发现同时加miR-20b抑制剂和U0126组,表达水平高于单独加U0126组,而低于单独加miR-20b抑制剂组。结论miR-20b和Erkl/2共同调控TF的表达。
【作者】俞妍慧；
【导师】陈方平；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】人胚胎干细胞；造血分化；滋养层细胞；组织因子；miRNA；Erk1/2；

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