EGCG调节p53和EGFR信号通路抑制人类肺癌细胞的分子机制研究

【摘要】背景：肺癌是人类肿瘤的头号杀手,其复发和转移是肺癌患者五年生存率得不到有效改善的主要原因。肿瘤抑制基因的过度失活与癌基因的异常活化在肺癌的发生发展中起着至关重要的作用。超过60%的肺癌中出现了肿瘤抑制基因p53的突变与功能异常；超过25%的肺癌中检测到了原癌基因c-erbB1(EGFR)的扩增。近年来,肿瘤的化学预防日益受到人们的关注,绿茶多酚EGCG是目前已知的最有效的天然抗肿瘤化合物之一。虽然已有研究证实EGCG能活化p53并能抑制EGFR信号通路,但其分子机制还不清楚。鉴于此,有必要对EGCG调节p53及EGFR信号通路抗肺肿瘤的分子机制作进一步研究。目的：首先以p53的翻译后修饰为切入点,通过分析p53蛋白的稳定性、转录活性及其负性调节因子MDM2对p53的降解作用,为EGCG诱导p53蛋白活化的分子机制提供实验依据。接着,以EGFR及其介导的信号转导通路为靶标,从EGFR激酶活性和转录活性入手,分析EGCG在多个层面对EGFR信号通路抑制的分子机制,为EGCG的肺癌预防与潜在的临床治疗应用提供理论依据。方法：首先,通过软琼脂集落形成实验和慢病毒介导的基因沉默技术,确认EGCG抗肺肿瘤的效果部分依赖于p53蛋白活性。接着,利用westernblot、荧光素酶双报告基因实验等方法,从p53蛋白稳定性,胞浆胞核分布及其反式激活能力等方面,证实EGCG诱导p53蛋白的积聚与活化。通过免疫共沉淀分析EGCG对MDM2与p53的结合能力及p53泛素化降解的影响。Westernblot分析EGCG对EGF诱导的EGFR信号通路活化的影响,检测EGCG对EGFR总蛋白、胞膜、胞核表达的影响及其反式激活能力的改变,再应用Westernblot分析EGFR靶基因cyclinD1的表达。最后,流式细胞术分析EGCG对肺癌细胞周期行进的影响。结果：1.Softagar结果表明,EGCG对p53野生型肺癌细胞具有更显著的抑制效果,基因沉默p53表达能增强肺癌细胞对EGCG的耐受能力。2.Westernblot结果显示,EGCG延长p53和MDM2的半衰期,并剂量依赖性上调p53Ser15和Ser20磷酸化及其下游靶基因MDM2和p21的表达,促进p53的核积聚。3.荧光素酶双报告基因实验结果提示,EGCG剂量依赖性上调p53的反式激活能力,差异有统计学意义(p<0.05)。4.免疫沉淀分析表明,EGCG显著抑制MDM2与p53的结合及MDM2介导的p53泛素化降解。5.EGCG剂量依赖性抑制EGF诱导的EGFR信号通路转导,如ERK1/2、AKT信号通路的活化及即刻早期基因c-Fos的表达。6.Westernblot结果显示,EGCG剂量依赖性和时间依赖性抑制EGFR的总蛋白、胞膜和胞核表达,并抑制EGFR的下游靶基因cyclinD1的表达。7.EGCG剂量依赖性抑制EGFR的反式激活能力,差异有统计学意义(p<0.05)。8.流式细胞术结果表明,EGCG剂量依赖性诱导肺癌细胞周期阻滞与Go/G1期。结论：1.EGCG活化抑瘤蛋白p53信号通路促进其抗肺肿瘤效果。EGCG通过上调p53的磷酸化,抑制MDM2与p53的相互作用从而抑制MDM2对p53的泛素化降解促进p53的稳定与积聚。EGCG通过促进p53的胞核积聚,上调其反式激活能力,从而诱导其下游靶基因如p21等的表达上调,干扰肺癌细胞周期行进。2.EGCG灭活致瘤蛋白EGFR信号通路发挥其抗肺肿瘤效果。EGCG通过抑制EGFR激酶活性,从而抑制EGFR介导的激酶活性依赖性信号转导。EGCG抑制EGFR的蛋白表达,促进EGFR激酶活性非依赖的反式激活能力抑制,从而抑制cyclinD1的表达,抑制细胞周期演进。
【作者】金龙玉；
【导师】喻风雷；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】肺癌；EGCG；p53；MDM2；泛素化；EGFR；cyclinD1；

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