Th2/Th17偏转微环境对人支气管上皮细胞重塑的作用及其机制研究

【摘要】背景：重症哮喘是一种以CD4+T淋巴细胞中Th2和Th17细胞分化占优势及气道重构为特点的慢性炎症性疾病。研究表明气道重构并非只是炎症细胞参与的结果,一些非炎性细胞如气道上皮细胞也扮演重要角色。在内外环境中各种刺激下,气道上皮细胞发生损伤、异常修复反应及细胞可塑性改变即通过“上皮重塑”来促进哮喘气道重构。上皮间质转变(EMT)是上皮重塑的典型表现之一,目前异常的EMT是哮喘气道重构机制研究的新热点。在重症哮喘患者气道中Th2和Th17源性细胞因子所介导的微环境对哮喘气道上皮细胞间质转变的作用尚不明确。因此探讨这些因子对气道上皮细胞间质转变的作用及其分子机制,有助于揭示上皮重塑在重症哮喘气道重构中的作用。在此基础上探寻逆转上皮重塑的可能途径,具有重要的学术价值和临床应用前景。目的：研究IL-4/IL-17A介导的Th2/Th17偏转微环境对气道上皮重塑的影响。并探讨其信号转导途径及逆转上皮重塑的可能途径。方法：1.TGF-β1、IL-4和IL-17A对气道上皮细胞的增殖抑制作用：以人支气管上皮细胞株16-HBE细胞为研究对象,采用CCK-8法检测TGF-β1、IL-4和IL-17A对16-HBE细胞上清液中OD值的影响。2.IL-4/IL-17A介导的Th2/Th17偏转微环境对气道上皮细胞间质转变的影响：以16-HBE细胞为研究对象,使用光学显微镜观察TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE细胞的形态学变化；采用免疫细胞化学法检测TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE细胞中a-SMA蛋白表达水平的变化；采用RT-PCR、WesternBlot方法检测TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE细胞中上皮-钙粘蛋白(E-cad)、a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)mRNA和蛋白表达水平的变化；采用ELISA法检测TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE细胞上清液中Ⅰ型前胶原氨基端原肽(PINP)表达水平的变化。3.TGF-β1、IL-4和IL-17A在促气道上皮EMT中的信号转导通路研究：以16-HBE细胞为研究对象,采用WesternBlot方法检测不同时间点TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE细胞中EGFR和p-EGFR、Smad3和p-Smad3、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达水平的变化；使用U0126(ERK途径拮抗剂)抑制TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激所诱导的16-HBE细胞中ERK1/2活化,采用RT-PCR、WesternBlot方法观察U0126在上皮间质转变中的作用。4.PPAR-γ激动剂抑制气道上皮细胞间质转变的研究：使用PPAR-γ激动剂罗格列酮(RGZ)干预TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激所诱导的16-HBE细胞,采用RT-PCR、WesternBlot探讨罗格列酮对气道上皮EMT的作用及可能机制。结果：1.TGF-β1、IL-4和IL-17A对气道上皮细胞的增殖抑制作用。(1)使用相应的刺激因子干预24小时,阳性对照组(含10%FCS的MEM培养液)能明显促进16-HBE细胞OD值增高(1.1014±0.0529),阴性对照组(含1%FCS的MEM培养液)中16-HBE细胞OD值较低(0.4446±0.0317),两者相比,在统计学上有明显差异(P<0.0001)；单独给予0、1、5、10、20ng/mlTGF-β1、处理16-HBE细胞,细胞上清液OD值未见明显变化(OD值：0.4453±0.031,0.4445±0.0331,0.4358+0.032,0.4171±0.0264；P=0.198)；单独给予0、1、5、10、20ng/mlIL-4刺激16-HBE细胞,细胞上清液OD值未见明显变化(OD值：0.4399±0.0263,0.4381±0.0296,0.4491±0.0299,0.4398±0.0261；P=0.836)；单独给予0、1、5、10、20ng/mlIL-17A刺激16-HBE细胞,随着干预药物浓度的增加,其OD值逐渐增高(OD值：0.4428±0.0324,0.4649±0.0199,0.5772±0.0592,0.6735±0.0558),各浓度组间存在统计学差异(P<0.0001),10或20ng/mlIL-17A可明显促进16-HBE细胞的增殖,与0、1、5ng/ml比较,差异有统计学意义(P<0.05),而0、1、5ng/ml各组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)；给予10ng/mlTGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激,所测得的OD值增高(OD：0.816±0.0559),统计分析显示与不同浓度的单个因子干预组(0、1、5、10、20)相比有明显统计学差异(P<0.05),提示给予TGF-β1、IL-4、IL-17A联合刺激时,有协同作用,能明显促进16-HBE细胞增殖。2.IL-4/IL-17A介导的Th2/Th17偏转微环境对气道上皮EMT的影响。(1)在光学显微镜下,对照组细胞呈典型的上皮细胞外观即鹅卵石状；单独给予10ng/mlIL-4或IL-17A刺激72小时后,16-HBE细胞形态无明显变化；单独给予lOng/mlTGF-β1、刺激后,16-HBE细胞形态由鹅卵石向梭状、纺锤形转变,细胞之间的连接变得松散,细胞间间隙增大。当多个因子联合刺激时,IL-4+IL-17A未能诱导16-HBE细胞形态发生明显变化；TGF-β1+IL-4或TGF-β1+IL-17A一起作用时,可诱导16-HBE细胞发生类似TGF-β1组的变化；而TGF-β1+IL-4+IL-17A一起作用时较TGF-β1组细胞形态变化更加显著。(2)在正常气道上皮细胞中a-SMA低表达,而发生上皮间质转变的细胞中a-SMA表达增高。使用各干预因素作用72小时后,应用细胞免疫化学法观察到空白组和对照组之间a-SMA表达(棕黄色颗粒)的平均灰度无明显统计学差异(P>0.05)；10ng/mlTGF-β1组与对照组比较,16-HBE细胞胞浆内a-SMA表达(棕黄色颗粒)明显增加,差异具有显著性(P<0.05);10ng/mlIL-4组与对照组比较,a-SMA表达(棕黄色颗粒)轻度增加与正常对照组相比,差异具有显著性(P<0.05)；10ng/mlIL-17A处理的16-HBE细胞胞浆内a-SMA表达(棕黄色颗粒)的平均灰度无明显变化,与对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。当多个因子联合刺激时,10ng/mlTGF-β1+IL-4或10ng/mlTGF-β1IL-17A或10ng/mlIL-4+IL-17A处理的16-HBE细胞胞浆内a-SMA表达(棕黄色颗粒)的平均灰度明显增加,与正常对照组相比,差异具有显著性(P<0.05)；而10ng/mlTGF-β1、+IL-4+IL-17A共同作用组与对照组相比,差异具有显著性(P<0.05)；与其他作用组比较,a-SMA表达进一步增加,差异具有显著性(P<0.05),提示TGF-β1、IL-4和IL-17A共同作用于16-HBE细胞,能进一步增强TGF-β1、诱导16-HBE细胞发生EMT的作用。(3)使用各刺激因子干预24小时,RT-PCR结果显示单个刺激因子作用时,10ng/mlTGF-β1组较对照组16-HBE细胞中E-cadmRNA表达水平降低,α-SMAmRNA表达水平增高,但差异均无统计学意义(P=0.10)；与对照组比较,10ng/mlIL-4组没有明显影响16-HBE细胞中E-cadmRNA表达水平,差异无统计学意义(P=0.577),轻度促进α-SMAmRNA的表达,但差异无统计学意义(P=0.082)；10ng/mlIL-17A组较对照组16-HBE细胞中E-cadmRNA表达水平降低,差异有统计学意义(P=0.005)；没有影响α-SMAmRNA表达水平,差异无统计学意义(P=0.577)。当多个因子联合刺激时,与对照组相比,10ng/mlTGF-β1+IL-4或10ng/mlTGF-β1+IL-17A或10ng/mlIL-4+IL-17A可降低16-HBE细胞E-cadmRNA表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)；增加16-HBE细胞a-SMAmRNA表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。当10ng/mlTGF-β1+IL-4+IL-17A三个因子共同刺激16-HBE细胞时,与其他任一干预因素相比,能进一步降低E-cadmRNA表达水平(P<0.01)；进一步增加a-SMAmRNA表达水平(P<0.01)。此外,RT-PCR的结果还显示lOng/mlTGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激,所诱导16-HBE细胞EMT呈时间依赖性,随着时间的延长(培养24h、48h、72h)E-cadmRNA的相对表达量逐渐降低,a-SMAmRNA的相对表达量随着时间的延长逐渐增高,差异有统计学意义P<0.05)。使用刺激因子干预72小时,WesternBlot结果显示,单个刺激因子作用时,10ng/mlTGF-β1组较对照组16-HBE细胞E-cad蛋白表达水平降低,α-SMA蛋白表达水平增高,差异均有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较,10ng/mlIL-4组没有影响16-HBE细胞E-cad蛋白表达水平,两者间无统计学差异(P=0.68),但增加α-SMA蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)；10ng/mlIL-17A组较对照组16-HBE细胞中E-cad蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),但没有影响α-SMA蛋白表达水平,差异无统计学意义(P=0.24)。当多个因子联合刺激时,与对照组相比,10ng/mlTGF-β1+IL-4或10ng/mlTGF-β1+IL-17A或10ng/mlIL-4+IL-17A均可降低16-HBE细胞E-cad蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.001),增加16-HBE细胞a-SMA蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.001)；当10ng/mlTGF-β1+IL-4+IL-17A三个因子共同刺激16-HBE细胞时,与其他干预因素相比,能进一步降低E-cad蛋白表达水平(P<0.01),进一步增加a-SMA蛋白表达水平(P<0.001)。(4)使用刺激因子干预72小时,ELISA检测结显示单个刺激因子作用时,与对照组相比,10ng/mlTGF-β1组或IL-4或IL-17A组均能促进16-HBE细胞培养上清液中PINP水平增高,不同干预组间存在统计学差异(均P<0.001),其中TGF-β1作用最显著(P<0.001)。当多个因子联合刺激时,与TGF-β1组相比,10ng/mlTGF-β1+IL-4或10ng/mlTGF-β1+IL-17A或10ng/mlIL-4+IL-17A或10ng/mlTGF-β1+IL-4+IL-17A均未能进一步增加16-HBE细胞培养上清液中PINP水平(P<0.01)。3.TGF-β1/IL-4/IL-17A在促气道上皮EMT中的信号转导通路研究。(1)WesternBlot结果表明TGF-β1、IL-4、IL-17A和TGF-β1/IL-4/IL-17A联合刺激均没有影响EGFR、Smad3、ERK1/2的基础表达。使用刺激因子干预5或60分,与对照组比,TGF-β1、IL-4.IL-17A和TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激均没有影响p-EGFR/EGFR比值(P>0.05)；与对照组比,给予刺激5分钟,TGF-β1、能增高p-Smad3/Smad3比值(P=0.008),给予刺激60分钟,p-Smad3/Smad3比值进一步增高(P<0.001),而IL-4、IL-17A及TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激5或60分钟p-Smad3/Smad3比值无明显变化(P>0.05)。与对照组比,TGF-β1、IL-4、IL-17A和TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激均能增高(p-ERK1/2)/(ERK1/2)比值,各组间存在统计学差异(P<0.001),其中TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激对(p-ERK1/2)/(ERK1/2)比值的增高作用最显著(p<0.05);TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激对(p-ERK1/2)/(ERK1/2)比值增加呈时间依赖性(P<0.05)。(2)WesternBlot结果显示20μMU0126明显抑制TGF-β1/IL-4/IL-17A共同作用所活化的ERK1/2信号通路(P=0.001)。U0126能恢复TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激所降低的E-cad蛋白水平(P<0.001),降低其所诱导的a-SMA蛋白水平(P<0.001)。这些结果说明TGF-β1,IL-4和IL-17A通过活化16-HBE细胞中的ERK1/2信号通路促进EMT。4.PPAR-γ激动剂罗格列酮抑制气道上皮细胞间质转变的研究。(1)使用刺激因子干预72小时,RT-PCR结果显示与对照组相比,10μMRGZ自身不能影响16-HBE细胞中E-cad(P=0.788)和α-SMAmRNA的基础水平(P=0.949)；10ng/mlTGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激能降低16-HBE细胞E-cadmRNA表达水平(P<0.001),增加α-SMAmRNA表达水平(P<0.001)；与TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激组比,10μMRGZ能部分逆转其作用,增加E-cadmRNA表达水平(P<0.001),降低α-SMAmRNA表达水平(P<0.001),差异有统计学意义。使用刺激因子干预72小时,WesternBlot结果显示,与对照组相比,10μMRGZ自身,不影响16-HBE细胞中E-cad(P=0.713)和α-SMA蛋白的基础水平(P=0.629);10ng/mlTGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激能降低16-HBE细胞E-cad蛋白表达水平(P<0.001),增加α-SMA蛋白表达水平(P=0.001)。与TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激组比,10μMRGZ能增加E-cad蛋白表达水平(P<0.001),降低α-SMA蛋白表达水平(P=0.002),差异有统计学意义,以上结果提示RGZ能逆转TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激所诱导的16-HBE细胞EMT。(2)WesternBlot结果显示10μMRGZ明显抑制TGF-β1/IL-4/IL-17A联合作用所活化的ERK1/2信号通路(P=0.001)。与对照组相比,TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激组降低16-HBE细胞中E-cad蛋白水平,增加a-SMA蛋白水平,与前文的结果类似,差异有统计学意义(P<0.001)。与IL-4和IL-17A共同刺激组比较,10μMRGZ,20μMU0126,10μMRGZ±20μMU0126能部分逆转其作用,增加16-HBE细胞中E-cad蛋白表达水平,降低a-SMA蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.001)；但三组间所产生的效应基本类似,三者间无统计学差异(P>0.05)结论：(1)Th2源性因子IL-4、Thl7源性因子IL-17A和致纤维化介质TGF-β1共同作用的微环境能直接促进气道上皮细胞增殖。(2)IL-4和IL-17A介导的Th2/Th7偏转微环境能增强TGF-β1对气道上皮细胞间质转变的作用。该作用是通过激活上皮细胞内的ERK1/2信号通路来实现的。(3)PPAR-γ激动剂罗格列酮可逆转在该培养环境下的气道上皮间质转变,其可能机制是通过抑制上皮细胞内的ERK1/2信号通路。
【作者】纪笑英；
【导师】向旭东；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】重症哮喘；气道重构；慢性炎性微环境；上皮间质转变；ERK1/2；罗格列酮；

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