HIV Vpr通过上调miR-122表达促进丙型肝炎病毒RNA复制及其蛋白合成

【摘要】背景和目的：HIV和HCV因有着共同的传播途径,其混合感染在临床上很常见。大量的研究证实在HIV/HCV混合感染患者中肝硬化和肝癌的发生率较HCV单独感染患者明显增高,且混合感染患者生存率降低,流行病学资料亦证实HIV/HCV混合感染者血清中HCVRNA载量较HCV单独感染者明显升高,提示HIV促进HCV复制,可能为HIV/HCV混合感染患者中HIV导致HCV肝脏疾病加重的主要原因。但到目前为止HIV/HCV混合感染中HIV影响HCV复制的具体机制仍未明确,且此方面的研究甚少,临床治疗措施有限,因此,开展HIV影响HCV复制分子发病机制的研究,一直是国内外HIV/HCV混合感染研究领域的亮点,且具有重要的临床与科学价值。HIV蛋白被发现在HIV影响HCV复制的过程中扮演着重要角色,而Vpr蛋白作为HIV重要的辅助蛋白之一,通过其介导HIV整合前复合物(preintegrationcomplex,PIC)的核运输,进而促进HIV-1感染未分化细胞；通过诱导细胞周期停滞在G2分裂期,调控HIV-1长末端重复序列(LTR)及宿主基因的转录激活,并调节NF-κB的活性,因而在HIV的持续感染和致病过程中有着重要作用。在本研究中,我们探讨了Vpr对HCV复制的影响及其调控机制,旨在为HIV影响HCV复制的机制提供新的实验依据。方法：通过构建HCV5’UTR驱动的荧光素酶报告基因和miR-122启动子驱动的荧光素酶报告基因,通过使用两种HCV感染细胞模型,HCVJFH1感染细胞模型和OR6细胞模型,采用荧光定量PCR技术、免疫蛋白印迹和荧光素酶活性实验检测Vpr对HCVRNA复制和HCV蛋白表达的影响。通过双荧光素酶活性实验检测Vpr对HCV5’UTR活性的调控影响。此外,通过双荧光素酶活性实验和RealtimePCR检测Vpr对miR-122启动子活性、precusormiR-122和miR-122mRNA转录影响。进一步通过使用miR-122抑制剂抑制miR-122的表达,予以荧光素酶活性实验、荧光定量PCR技术和免疫蛋白印迹检测miR-122在Vpr上调HCV5’UTR活性,促进HCVRNA复制和HCV蛋白表达中的影响。结果：通过构建HCV5’UTR驱动的荧光素酶报告基因,我们发现Vpr可上调HCV5’UTR的活性,呈剂量依赖性。另外,通过使用Molt-4细胞和Huh7.5.1细胞共培养,结果发现Vpr可从淋巴细胞中分泌出来,独立进入肝细胞中发挥生物学效应。Vpr在JFH1感染细胞系统中显著促进HCVRNA的复制和HCV蛋白的表达；在OR6细胞中,Vpr同样可明显上调HCV海肾荧光素酶活性,并增强HCV蛋白的表达。Vpr稳定表达细胞株予以HCVJFH1感染后也证实Vpr可在JFH1感染后72小时和30d均明显促进HCVRNA的复制及增强HCV蛋白的表达。进一步的研究表明Vpr可通过上调miR-122的启动子活性,precusormiR-122和miR-122mRNA转录进而在转录水平上调miR-122的表达。另外,使用针对miR-122的抑制剂,能显著阻断Vpr对HCV5’UTR的上调作用,同样还可在JFH1感染系统和OR6细胞中miR-122抑制剂显著废除Vpr对HCVRNA复制和HCV蛋白的影响。结论：我们的研究结果证实Vpr通过上调miR-122的转录水平,并上调HCV5’UTR的活性,从而促进HCVRNA的复制和增强HCV蛋白的表达。同时首次发现Vpr可从淋巴细胞中分泌出来,独立地进入肝细胞中发挥生物学效应。这些研究结果说明miR-122在Vpr促进HCV复制中起关键作用,为HIV影响HCV复制的机制提供了新的研究方向。
【作者】彭米林；
【导师】龚国忠；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】HIV；HCV；混合感染；Vpr；MiR-122；

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