C/EBPs诱饵寡核苷酸对脓毒症小鼠多器官损伤的保护作用及机制研究

【摘要】背景及目的：脓毒症(sepsis)是感染导致的全身炎症反应综合征(systeminflammatoryresponsesyndrome,SIRS),是重症监护病房(ICU)内常见并发症及首要死亡原因。脓毒症治疗花费高,医疗资源消耗大,对人类健康和社会经济造成巨大威胁。CCAAT增强子结合蛋白(CCAATenhancerbindingprotein,C/EBPs)是一组属于碱性亮氨酸拉链(basicregionleucinezipper,bZIP)家族的转录调控因子,目前已发现6个成员：α、β、γ、δ、ε和ζ。其中成员α、β、δ及ε在各种炎症性疾病急性期反应中发挥关键作用,且作为转录因子有着共同的特异性识别序列RTTGCGYAAY(其中R为A或G,Y为C或T)。因此,为了寻找新的脓毒症防治靶点,本研究采用转录因子诱饵策略(transcriptionfactordecoystrategy,TFDs)体外合成针对转录因子C/EBPs的哑铃形诱饵寡脱氧核苷酸(C/EBPsdecoyODNs),然后探讨了C/EBPsdecoyODNs对脓毒症的影响及其机制。方法：1)体外实验：先采用免疫印迹分析(westernblot,WB)及凝胶滞留实验(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)观察LPS(1μg/mL)刺激下RAW264.7细胞内C/EBPs蛋白表达水平及DNA结合活性的变化以期验证C/EBPs在炎症反应中发挥重要作用；然后设计合成针对转录因子C/EBPs的特异性哑铃形decoyODNs及用于对照的突变寡脱氧核苷酸(C/EBPsmutantODNs),在采用电泳及EMSA验证ODNs的合成符合设计要求后用阳离子转染试剂TurboFect将荧光基团FAM标记的ODNs转染入RAW264.7细胞,分别采用流式细胞术检测ODNs转染效率；Hoechst染核后经荧光显微镜观察decoyODNs在细胞内的分布；alamarBlue实验观察ODNs的细胞毒性；WB观察其对C/EBPs蛋白表达水平的影响；采用ELISA检测|C/EBPsdecoyODNs对LPS(1μg/mL)刺激下RAW264.7细胞上清中细胞因子TNF-a,IL-1β及IL-6的表达影响；采用Real-timePCR检测C/EBPsdecoyODNs对LPS(1μg/mL)刺激下RAW264.7细胞内多个C/EBPs炎症相关靶基因的表达影响。2)体内试验：采用盲肠结扎穿刺(CLP)制备脓毒症小鼠模型,经量效实验和时效实验观察C/EBPsdecoyODNs对脓毒症小鼠存活率的影响；尾静脉注射FAM标记的C/EBPsdecoyODNs6h及24h后检测组织匀浆上清荧光密度观察decoyODNs的器官分布及停留情况；然后通过检测反应多器官损伤的血清生化指标及多器官光镜下形态学变化观察C/EBPsdecoyODNs对脓毒症小鼠多器官损伤的保护作用；采用ELISA检测C/EBPsdecoyODNs对脓毒症小鼠血清细胞因子TNF-α,IL-1β及IL-6的表达影响,采用Real-timePCR检测C/EBPsdecoyODNs对肺组织中多个C/EBPs炎症相关靶基因表达的影响。结果：1)体外实验：RAW264.7细胞中CEBPα蛋白在基础状态下表达较高,LPS刺激后1h即开始降低,于6h降到最低峰,之后又开始上升,于24h恢复到基础水平；CEBPβ基础水平较低,LPS刺激后1h即开始升高,于12h达到高峰,24h又开始下降,但仍高于基础水平；CEBPδ基础水平较低,LPS刺激后1h即开始升高,一直持续至24h;CEBPε于LPS刺激后6h开始升高,24h又开始下降,但仍高于基础水平。细胞核中CEBPα、β、δ及ε的表达变化与其在细胞总蛋白中的表达情况基本一致；但CEBPα蛋白在LPS刺激后6h才开始降低；CEBPε则于LPS刺激后1h则有所下降,于3h开始升高,一直持续至24h。C/EBPsDNA结合活性在LPS刺激后1h即开始增加,于6h和12h时达到高峰,C/EBPs的这种高水平的DNA结合活性一直持续到24h；且CEBP(3及CEBPδ的DNA结合活性远高于CEBPα和CEBPε。电泳及EMSA结果表明C/EBPsdecoyODNs和mutantODNs符合设计要求。转染ODNs4h之后,RAW264.7细胞C/EBPsdecoyODNs和C/EBPsmutantODNs的转染效率分别为87.35%及87.71%；荧光显微镜下观察,发现转染4h之后decoyODNs大部分定位于细胞核；C/EBPsdecoyODNs和mutantODNs均无明显细胞毒性作用；C/EBPsdecoyODNs和：mutantODNs不影响RAW264.7细胞中CEBPα、β、δ及ε蛋白表达水平。C/EBPsdecoyODNs能抑制LPS刺激下RAW264.7细胞TNF-α,IL-1β及IL-6的表达。C/EBPsdecoyODNs能抑制LPS刺激下RAW264.7细胞IL-6,IL-1β,IL-18,MCP-1,MIF,caspase-1,NF-κB1,ICAM1,VCAM1和Fgα的mRNA表达。2)体内试验：量效实验表明CLP后立即给予小剂量(10μg)、中剂量(30μg)、大剂量(90μg)C/EBPsdecoyODNs干预分别可使CLP所致的脓毒症小鼠存活率提高30%、60%及70%;C/EBPsmutantODNs干预则对脓毒症小鼠存活率无明显影响。时效实验发现术后0、3、6、12h给予C/EBPsdecoyODNs(30μg)干预可使脓毒症小鼠存活率提高60%、50%、40%及30%。尾静脉注射6h后,C/EBPsdecoyODNs在肝、肺、肾组织中均有分布；注射24h之后,C/EBPsdecoyODNs在肝、肺组织中仍有停留,而肾组织中则已检测不到。C/EBPsdecoyODNs降低脓毒症小鼠血清生化指标BUN,Cr,ALT,AST,LDH及CK-MB水平,减轻其心、肝、肺、肾的组织损伤；C/EBPsdecoyODNs降低脓毒症小鼠血清炎症因子TNF-α,IL-1β及IL-6表达水平；C/EBPsdecoyODNs降低脓毒症小鼠肺组织多个炎症相关因子IL-6,IL-1β,IL-18,MCP-1,MIF,caspase-1,NF-κB1,ICAM1,VCAM1及Fgα的mRNA表达。结论：C/EBPs在LPS所致的炎症反应中发挥重要作用,可作为脓毒症防治的潜在干预靶点；C/EBPsdecoyODNs通过干扰C/EBPsDNA结合活性而抑制多个炎症相关靶基因的表达,从而发挥对脓毒症小鼠多器官损伤的保护作用。
【作者】高敏；
【导师】肖献忠；
【作者基本信息】中南大学，病理学与病理生理学，2013，博士
【关键词】C/EBPs；C/EBPsdecoyODNs；炎症；脓毒症；多器官功能障碍；全身炎症反应综合症；炎症相关基因；

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