核肌球蛋白在Nox2介导的心肌缺血性损伤中的作用及机制

【摘要】研究背景心肌缺血／再灌注(ischemia/reperfusion,IR)损伤是缺血心肌恢复血液灌流后损伤进一步加剧的现象。心肌IR损伤涉及多种机制,氧化应激是其中之一。氧化应激损伤由活性氧(reactiveoxidativespecies,ROS)过量所致。缺血心肌中ROS主要来源于NADPH氧化酶(NADPHoxidase,Nox)。心肌细胞主要表达Nox2和Nox4两种亚型,Nox可以催化氧分子得电子生成超氧阴离子。超氧阴离子极不稳定,介导氧化损伤作用有限,而且很快转化为H2O2,H2O2在过氧化物酶催化下生成氧化活性更强的HOCl,引起心肌细胞损伤(包括细胞凋亡)。血管过氧化物酶(vascularperoxidase,VPO)为新发现的过氧化物酶家族成员,能催化H2O2生成氧化活性更强的HOCl,心脏中主要表达VPO1。我们推测Nox2和VPO1可能以H2O2为中介形成Nox/VPO1途径参与介导IR氧化应激损伤。为此,我们采用了大鼠IR和心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,HR)模型探讨该途径在IR损伤中的作用及机制,该研究将丰富心肌IR损伤的氧化应激学说,也为抗心肌IR的治疗和新药的开发提供新思路。方法我们首先采用大鼠心肌IR模型,结合Nox抑制剂(apocynin、DPI)探讨了Nox2在心肌IR中的作用以及Nox2与VPO1的相关性。然后,利用H9c2心肌细胞HR模型,结合药物干预和基因沉默技术,进一步确定了Nox/VPO1途径在IR中的作用和机制。TTC法检测大鼠心肌梗死面积；比色法检测血浆CK活性、caspase-3、Nox活性和H2O2水平；心脏HE染色检查心肌病理结构的改变；TUNEL、hochest染色法检测心肌细胞凋亡；免疫组织化学法检测心肌caspase-3表达；免疫荧光双标定位Nox2、VPO1的表达；realtimePCR检测心肌Nox2、Nox4、VPO1mRNA表达水平；Westernblot检测Nox2、VPO1、p-JNK、p-p38蛋白表达水平；荧光探针法检测心肌细胞HOCl水平。结果IR导致心肌梗死面积增大、血清CK活性升高、心肌细胞凋亡增加,apocynin或DPI干预均能抑制心肌IR损伤；IR能上调心肌Nox2、VPO1表达,升高Nox活性和血浆H2O2水平,Nox4表达无明显变化,apocynin或DPI干预均能抑制VPO1表达、Nox活性和血浆H2O2水平升高,DPI还能抑制Nox2表达上调,但apocynin无此作用；apocynin干预、Nox2或VPO1基因沉默或二者共沉默均能抑制心肌细胞HR损伤；HR能上调心肌细胞Nox2、VPO1表达,升高Nox活性、HOCl和H2O2水平,apocynin干预、Nox2或VPO1基因沉默或二者共沉默均能抑制VPO1表达增加和HOCl水平升高,Nox2基因沉默和Nox2、VPO1双基因沉默均能明显抑制心肌细胞Nox2表达、Nox活性和H2O2生成,但单独沉默VPO1基因对Nox2表达、活性及H2O2生成无影响；SOD抑制剂干预对HR引起的H2O2水平升高无明显效应；H2O2能浓度依赖性诱导VPO1表达,JNK或p38MAPK干预能抑制H2O2上调VPO1表达的作用。结论心肌缺血/再灌注时,Nox2与VPO1以H2O2为中介形成Nox2/VPO1途径,二者通过协同作用,共同参与心肌缺血/再灌注氧化损伤。研究背景心肌缺血／再灌注(ischemia/reperfusion,IR)时Nox2、VPO1表达增加,Nox2与VPO1以H202为中介形成Nox2/VPO1途径,参与介导心肌IR氧化损伤。Nox2来源的H202经由JNK/p38MAPK信号通路诱导VPO1表达,后者在心肌IR损伤中起重要作用。然而,Nox2作为VPO1作用上游其表达上调的机制尚未阐明。肌球蛋白是一种细胞骨架和肌肉收缩相关分子,由重链、必需轻链和调节轻链(myosinregulatorylightchain,MLC20)组成。肌球蛋白除参与肌肉收缩以外,还参与调节细胞的迁移、粘附和血管内皮的通透性等。新近文献报道,存在于人肠道平滑肌细胞核内的MLC20也能与RNA聚合酶Ⅱ(RNApolymeraseⅡ,RNApolⅡ)、转录因子IIB(transcriptionfactorIIB,TFIIB)结合形成转录起始复合物,参与结肠环状平滑肌细胞ICAM-1基因的转录调节,此过程涉及MLC20磷酸/去磷酸化。肌球蛋白是否也存在于心肌细胞核内?肌球蛋白除了参与心肌收缩外是否还具有其他功能?Nox2在心肌IR损伤中起重要作用,心肌细胞核肌球蛋白是否调节Nox2表达?通过生物信息学预测,Nox2基因启动子上游区域存在MLC20结合位点。因此,我们于在体心肌IR动物和离体心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,HR)模型探讨核肌球蛋白在心肌IR损伤中的作用及机制。方法我们首先采用大鼠心肌IR模型,结合MLCK抑制剂(ML-7)干预手段,,探讨了MLC20在心肌IR损伤中的作用以及与Nox2之间的联系；然后,利用H9c2心肌细胞HR模型,结合药物干预、基因沉默、免疫共沉淀和染色质共沉淀等技术确定了MLC20对Nox2的表达调控机制。TTC法检测大鼠心肌梗死面积；比色法检测血浆CK活性、caspase-3、Nox活性和H2O2水平；心脏HE染色检查心肌病理结构的改变；TUNEL、hochest染色法检测心肌细胞凋亡；免疫组织化学法检测心肌caspase-3表达；细胞免疫荧光检测心肌细胞MLC20的定位、分布；realtimePCR检测心肌Nox2mRNA表达水平；Westernblot检测Nox2、胞浆、胞核MEC20蛋白和磷酸化水平；免疫共沉淀检测MLC20与RNApolⅡ、TFIIB的结合；染色质免疫共沉淀检测MLC20与Nox2基因启动子上游靶序列的结合。结果IR能导致心肌梗死面积增大、血清CK活性升高、心肌细胞凋亡增加,ML-7干预能减轻心肌IR损伤；IR组Nox2表达、H202水平和胞核P-MLC20水平明显升高,胞浆、胞核MLC20水平无变化,ML-7干预能显著降低R诱导的Nox2表达、升高H202水平和胞核P-MLC20水平,而胞浆、胞核MEC20水平无变化；HR能诱导心肌细胞凋亡增加,应用ML-7或沉默MLC20基因能减少心肌细胞凋亡；HR组Nox2表达、胞核P-MLC20和H202水平均明显升高,胞浆、胞核MLC20水平无变化,应用ML-7或沉默MLC20基因能显著降低HR诱导的Nox2表达、升高H2O2和胞核p-MLC20水平,MLC20基因沉默能降低胞浆、胞核MLC20水平；免疫共沉淀结果显示p-MLC20能与RNApolⅡ、TFⅡB结合；染色质免疫共沉淀结果显示HR能诱导核p-MLC20结合Nox2基因启动子上游-289～-284位之间反义链上的AGCTCC序列,ML-7干预能抑制二者的结合。结论在心肌组织,核肌球蛋白是一种核转录因子,其促进心肌IR损伤的机制是通过MLC20磷酸化而调节Nox2表达。
【作者】张一帅；
【导师】李元建；
【作者基本信息】中南大学，药理学，2013，博士
【关键词】缺血/再灌注；缺氧/复氧；氧化应激；活性氧；Nox2；VPO1；心肌细胞凋亡；核肌球蛋白调节轻链；磷酸化；转录调控；

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