Dkk1在骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化的分子调节机制的实验研究

【摘要】[目的]通过DKK1干扰探讨DKK1在骨髓间充质干细胞早期成骨、成脂分化的调节作用,分析其调节机制。[方法]1.Realtime-PCR检测骨髓间充质干细胞成脂、成骨诱导培养早期Dkkl基因表达水平；骨髓间充质干细胞激素作用下DKK1基因表达检测。2.根据shRNA靶位点的选择原则,从TRCshRNA数据库及AmbionshRNA数据库中择优选取三条DKK1shRNA序列,通过DKK1构建过表达载体,筛选出最佳干扰序列,体外同源重组构建DKK1-shRNA腺病毒表达载体,经酶切、PCR鉴定、测序。3.rAd-EGFP转染骨髓间充质干细胞荧光表达观察；腺病毒对细胞增殖影响分析；Ad-DKK1-shRNA转染骨髓间充质干细胞,转染后分别行成脂、成骨诱导培养,分别检测其分化特异因子以及相关的特异蛋白的表达水平,分析其与对照组数据的差异性。并行组织染色观察其形态学变化。[结果]1.实验应用realtime-PCR检测Dkkl基因在大鼠BMSCs成脂、成骨分化48小时内的相对基因表达水平,通过目的基因的扩增动力学曲线得出Ct值,经内参β-actin校正计算出目的基因的相对表达量ΔCt值,组间比较采用两独立样本t检验：成脂组与正常对照组,在成脂诱导6、12、24、48时dkkl基因表达水平较对照组增高,差异有统计学意义,P<0.01。成骨组与正常对照组,0.5、6两个时间点Dkkl基因表达量较对照组明显降低,差异有统计学意义,P<0.05。骨髓间充质干细胞激素处理3、6、12、24时,realtime-pcr检测DKK1基因表达,结果显示激素作用下,骨髓间充质干细胞DKK1表达明显增加。2.成功构建pYr-1.1-DKK1-shRNA-153、pYr-1.1-DKK1-shRNA-155、pYr-1.1-DKK1-shRNA-Am表达载体,分别通过RT-PCR与Westernblotting检测DKK1的表达,结果显示pYr-1.1-DKK1-shRNA-153为最佳干扰序列。3.荧光显微镜下观察荧光蛋白表达情况显示,MOI-10、20均可较高的转染骨髓间充质干细胞；腺病毒转染骨髓间充质干细胞,MOI-5、10、20、30、40、50pfu/cell在转染后3天,对细胞增殖无明显影响；sh-DKK1明显抑制骨髓间充质干细胞成脂分化。sh-DKK1促进成骨蛋白Osteocalcin表达和coll-I蛋白表达。[结论]Dkkl在骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化早期可能起重要的调节作用,激素可能通过调节DKK1的表达而发挥调节成骨、成脂分化的作用DKK1干扰明显抑制骨髓间充质干细胞早期成脂分化,促进骨髓间充质干细胞成骨蛋白表达,促进早期成骨分化。DKK1在骨髓间充质干细胞早期成骨、成脂分化中发挥重要调节作用。
【作者】李哲海；
【导师】廖前德；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】骨髓间充质干细胞；dkk1；wnt信号；成骨；成脂分化；

【参考文献】
[1]王夏冉.压缩天然气加气站系统配置及运行节能的研究[D].山东建筑大学,动力工程（专业学位）,2013,硕士.
[2]孙旭.复杂系统的多模型建模及预测控制[D].华东交通大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[3]曹令今.基于DLL的时钟产生器设计[D].吉林大学,集成电路工程（专业学位）,2013,硕士.
[4]曾婉艺.CeO_2可控纳米结构与固溶体的合成及光催化性能研究[D].北京化工大学,化学工程（专业学位）,2013,硕士.
[5]朱红波,褚天宇,徐铭营.低碳金融视角下的银行业务拓展[J].辽宁工程技术大学学报(社会科学版),2014,03:261-264.
[6]郑凯.当前中学生追星现象及其引导研究[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.
[7]姚威威,陈枫,傅强.石墨烯/聚乙烯醇双网络水凝胶的制备及其性能研究[A].中国化学会高分子学科委员会.2013年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——主题J：高分子复合体系[C].中国化学会高分子学科委员会:,2013:1.
[8]罗润.无效法律行为转换制度研究[D].西南政法大学,民商法学,2012,硕士.
[9]郝兴明,陈亚宁,李卫红,郭斌,赵锐锋.胡杨根系水力提升作用的证据及其生态学意义[J].植物生态学报,2009,06:1125-1131.
[10]张旭卫.基于LBP-SVM的极光识别研究[D].西安电子科技大学,电路与系统,2012,硕士.
[11]张茜.在校大学生残疾人认知及社工介入的研究[D].山东大学,社会工作（专业学位）,2013,硕士.
[12]吕春旭.慢病毒介导的cbfα1和satb2对Wistar大鼠牙周缺损修复再生作用的研究[D].山东大学,口腔临床医学,2013,硕士.
[13]孙少锋.上海城市居民住房需求偏好与消费行为研究[D].暨南大学,2004.
[14]蒋中秀.siRNA干扰PECAM-1对人鼻咽鳞癌辐射耐药细胞CNE1/R中MDR-1表达的影响[D].大连大学,肿瘤学,2012,硕士.
[15]黄旭,刘建华,王慧明,朱慧勇,李志勇,滕理送.口内入路下颌骨良性肿瘤切除同期自体骨移植修复重建术的临床研究[J].中国修复重建外科杂志,2014,02:192-196.
[16]汪颜.量子进化组播路由算法研究[D].西安电子科技大学,电路与系统,2012,硕士.
[17]胡召永,解桂林,郭志航,王勤辉,方梦祥,骆仲泱,岑可法.热解温度对高水分印尼褐煤半焦孔隙特性及燃烧特性的影响[J].热力发电,2014,10:74-78.
[18]李宇杰,王梦恕,徐会杰,张元.地铁矿山法区间隧道病害分级标准及补强对策[J].都市快轨交通,2014,01:86-89.
[19]严洁.央视“春晚”的叙事研究[D].湖南师范大学,影视戏剧文学,2013,硕士.
[20]冉思丝.高职院校就业指导工作中思想政治教育的问题与对策研究[D].西南大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[21]郑海青.新媒体时代衡阳市政府网络公关问题研究[D].湖南大学,公共管理,2013,硕士.
[22]曹健.BLU基因启动子高甲基化与胃癌关系的初步研究[D].苏州大学,消化内科,2014,硕士.
[23]孙启梦.战略导向对国际新创企业绩效的影响机制研究[D].浙江大学,创业管理,2012,硕士.
[24]王志华.地铁车站运营安全风险评价研究[D].北京交通大学,2012.
[25]杨欣.不同体育锻炼方式对老年人人际交往的影响[D].河北师范大学,体育教育训练学,2012,硕士.
[26]孟子诤.铁路综合视频监控系统的应用研究[D].燕山大学,控制工程,2012,硕士.
[27]许翀.基于OpenGL-ES的嵌入式数控仿真系统[D].华南理工大学,控制工程,2012,硕士.
[28]梅立乔.晚清徽州文化生态研究[D].苏州大学,中国近现代史,2013,博士.
[29]钱玉皓.基于能值理论的武穴市耕地系统利用效益研究[D].华中师范大学,土地资源管理,2013,硕士.
[30]王志敏.煤炭企业履行社会责任的财务效率研究[D].燕山大学,会计学,2013,硕士.
[31]毛克彪,覃志豪,张万昌.针对ETM基于BP网络像元分解模型分类研究[J].遥感信息,2004,02:27-30.
[32]闫佳佳.锻态2.25Cr1Mo0.25V钢热变形组织演变预测及数值模拟[D].太原科技大学,材料加工工程,2013,硕士.
[33]梁宇.大规模风电场并网运行的故障分析及保护策略研究[D].华中科技大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[34]郑阳.结构抗连续倒塌关键构件的评价方法及敏感性分析[D].浙江大学,结构工程,2013,硕士.
[35]叶丽霞.城市公共自行车调度系统研究[D].南京理工大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[36]郎兰.语言比较法和“他昨天去的北京”中“的”的研究[D].安徽大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[37].浙江省营养学会第六次会员代表大会在杭州召开[J].营养学报,2015,01:105.
[38]李淑清.剪切机刀片的手工研磨[J].工具技术.2008(03)
[39]彭飞.施道克公司A产品生产效率优化[D].吉林大学,工业工程,2013,硕士.
[40]李璇.英语口译课堂焦虑状况实证研究[D].湖北大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[41]王国权,余群,卜云龙,于德年,王彩梅.秸秆捡拾打捆机设计及捡拾器的动力学仿真[J].农业机械学报.2001(05)
[42]唐文艳.“数学情境与提出问题”教学模式的研究性学习因素及体现[D].贵州师范大学,课程与教学论,2004,硕士.
[43]徐武杰.生物絮团在对虾零水交换养殖系统中功能效应的研究与应用[D].中国海洋大学,水产养殖,2014,博士.
[44]安东.EDTA对树脂基纳米水合氧化铁稳定性及其除重金属性能的影响[D].南京大学,环境科学与工程,2013,硕士.
[45]冯文周.多跨转子系统振动的可靠性灵敏度与可靠性稳健设计[D].东北大学,机械设计及理论,2010,硕士.
[46]戴培华.Pd/LaNiO_3复合薄膜电极材料在碱性溶液中的电化学行为研究[D].兰州理工大学,材料学,2014,硕士.
[47]鄢勇.面向生产自动化的精冲有限元分析及模具保护策略研究[D].武汉纺织大学,机械工程,2014,硕士.
[48]向海波.一种来源于Enterobacter sp.CGMCC2487菌株的木糖苷酶基因的克隆、异源表达及产物的生化特性研究[D].湖北大学,微生物与生化药学,2011,硕士.
[49]王进斌.一类微气泡耦合时滞系统的稳定性以及Hopf分支[D].哈尔滨工业大学,应用数学,2014,硕士.
[50]杨颖.电视节目管理系统[D].天津大学,软件工程,2013,硕士.