盐度诱导太平洋牡蛎和近江牡蛎三倍体的研究

【摘要】牡蛎是我国重要养殖贝类，年总养殖产量居于贝类之首。三倍体牡蛎由于其育性差、生长快、品质好等诸多优于二倍体的特性而成为牡蛎养殖业的重要组成部分，深受消费者青睐。目前，三倍体牡蛎的获得主要有两种途径：一是采用理化方法抑制正常受精卵第二极体的排放，一是利用二倍体与四倍体牡蛎杂交产生100%的三倍体。国内三倍体牡蛎的生产多采用第一种途径，利用6-DMAP、温度休克等理化方法诱导。本研究中我国养殖牡蛎的主要品种——太平洋牡蛎（Crassostreagigas）和近江牡蛎（Crossostreaariakensis）为对象，尝试通过高盐或低盐抑制受精卵第2极体的释放，诱导牡蛎三倍体。本方法安全无毒、价格低廉，适用于牡蛎三倍体产业生产，具有广阔的应用前景。研究主要分为以下两部分：一、高盐诱导太平洋牡蛎三倍体本研究中，首先通过荧光染色法显微观察太平洋牡蛎精卵受精及早期胚胎发育过程，发现23℃水温条件下，近江牡蛎在受精后25分钟左右出现第1极体（PB1）这有助于多倍体诱导时机的准确把握。其次，首次采用高盐抑制太平洋牡蛎受精卵第2机体释放产生三倍体，探索了高盐诱导三倍体最佳诱导的最适条件。在水温为25℃的条件下，分别在不同高盐处理液（盐度分别为40、45、50、55、60、65、70、75、80ppt），在不同处理时机,当首次、30%、50%出现PB1，以及首次、50%出现PB2时,将太平洋牡蛎受精卵放入处理液中，持续处理10、15、20、25min。之后将受精卵置于正常海水（盐度为35ppt）中孵化。使用300目筛绢网过滤海水获取初孵D-型幼虫，通过流式细胞仪进行倍性测定,以确定最佳诱导条件。通过诱导率及综合评价指数的分析表明，高盐诱导太平洋牡蛎多倍体的最佳参数为：盐度为65，处理时机为50%PB出现，处理持续时间20min。按照最适条件，在受精卵出现50%PB1时,以盐度65的高盐海水处理受精卵20min，幼虫的三倍体诱导率为65.53%。通过荧光学观察，太平洋牡蛎受精卵在受精后25min左右出现第一极体，30分钟左右第一极体全部排出。由此可以确定在使用高盐诱导太平洋牡蛎三倍体过程中的诱导时机的选择。最后，对使用高盐诱导的三倍体牡蛎（8月龄）进行了染色体组成观察，发现了染色体缺失现象，亦即非整倍体现象。其中二倍体水平上的染色体缺失表现为2n-1和2n-2，染色体数目为18或19条；三倍体水平上的缺失发现了2种情况，3n-1和23n-4,染色体数为29和26。非整倍体现象的出现可能与多倍体染色体组的不稳定性有关。二、低盐诱导近江牡蛎三倍体1.低盐对近江牡蛎精卵影响及海水对解剖卵的促熟作用用自然海水按一定比例加入蒸馏水，配制盐度为5，10，15，20，25，30的海水。将精子滴加入不同盐度的海水中，定时观察精子的活动情况。结果表明低盐海水对精子的活动能力有明显影响，精子的存活时间随着盐度的降低而缩短，当盐度在10及以下时，3min内精子失去运动能力；随着盐度的升高，精子的存活时间延长，盐度为25及30时，精子在2h内保持活跃状态，3h活跃度有所降低，但仍有40%以上精子活跃。盐度对牡蛎卵子的形态和受精能力也有明显影响。将卵子浸泡在不同盐度海水中10min后，发现卵子形态大小发生变化，其卵径大小与盐度间呈现出负相关趋势。浸泡25min后，受精实验结果表明，受精率与盐度之间表现出正相关趋势，卵子的受精率随着盐度降低而迅速降低，当盐度低于10ppt时，受精率为0。正常海水浸泡对牡蛎的卵子有促熟作用。浸泡时间在0.5-1.5h，牡蛎卵子具有较高的受精率，但浸泡时间再延长，至2h以后之后则出现受精率降低的现象。实验结果表明近江牡蛎体解剖卵的外促熟适宜最适时间为0.5-1.5h。2.低渗诱导近江牡蛎三倍体研究2.低渗诱导近江牡蛎三倍体，分别在20%-30%、40%-50%以及60%-70%的受精卵出现PB1时,采用不同的低盐（盐度为6、8、10、12、14、16）处理近江牡蛎的受精卵10、15、20min，然后将受精卵移入盐度为30的正常过滤海水中孵化。当孵化出D-型幼虫时，收集幼虫，DAPI荧光染色后，用流式细胞仪进行倍性测定。通过诱导率及综合评价指数的分析表明，低盐诱导近江牡蛎多倍体的最佳参数为：盐度为8，处理时机为40%-50%受精卵出现PB1，处理持续时间15min。按照实验得出的最适条件，在受精卵出现40%-50%PB1时,以盐度为6的低盐海水处理受精卵15min，幼虫的三倍体诱导率为89.03%，孵化率为80.23%，综合评价指数为71.43。研究结果显示低渗诱导对于近江牡蛎是一种十分有效的三倍体诱导方法，具有良好的生产应用前景。
【作者】王康；
【导师】王昭萍；
【作者基本信息】中国海洋大学，水产养殖，2014，硕士
【关键词】高盐诱导；太平洋牡蛎；近江牡蛎；低渗诱导；综合评价指数；

【参考文献】
[1]李金荣.工作不安全感与工作—家庭冲突及主观幸福感的关系研究[D].华侨大学,企业管理,2014,硕士.
[2]李瑞,徐壮,徐殿国.直驱型变速恒频风力发电系统的独立直流母线并联策略[J].中国电机工程学报,2012,03:56-66+15.
[3]金一.论刑事诉讼行为无效制度的完善[D].辽宁大学,法律,2012,硕士.
[4]郦胤清.“以人为本”视角下的政府公信力构成要素探究[D].成都理工大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[5]刘发升,杨惠.一种启发式精简规则挖掘算法及其SQL实现[J].计算机应用,2003,10:117-118+123.
[6]杨志杰.ABO_3（A=Ba；B=Fe，Co）钙钛矿型阴极材料的电性能及其应用[D].苏州大学,无机化学,2012,硕士.
[7]梁晓楠.CISG视阈下宽限期制度研究[D].大连海事大学,法律,2014,硕士.
[8]吴广勇.高中生生物学习能力和考试焦虑的相关研究[D].山东师范大学,教育,2012,硕士.
[9]张勇.阵列CCD单色仪的研制[D].郑州大学,光学,2013,硕士.
[10]张艳梅.甜菜糖蜜的改性及应用研究[D].济南大学,化学工艺,2012,硕士.
[11]袁国茗.便携式DVD输出信号测试调整系统的设计[D].大连理工大学,机械工程（专业学位）,2013,硕士.
[12]王韬.A公司家庭宽带业务流程优化研究[D].华南理工大学,物流工程,2012,硕士.
[13]刘海翔.泉州市教育部门信息化发展策略研究[D].华侨大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[14]束洪春,邬大明,陈学允,许承斌.基于模式分析的对称和非对称三相不接地系统故障测距算法研究[J].自动化学报,1997,05:129-133.
[15]马丽卿.收入结构对我国上市商业银行绩效影响的实证分析[D].山西财经大学,金融学,2013,硕士.
[16]吕丰香.迷走神经复合体注射GLP-1对不同病程糖尿病大鼠下丘脑GLP-1受体表达及胃排空的影响[D].青岛大学,消化内科,2013,硕士.
[17]高子茗.论电视剧复线结构艺术[D].山东艺术学院,广播电视艺术学,2012,硕士.
[18]夏立喜.农村综合高中办学模式研究[D].江西师范大学,教育管理,2003,硕士.
[19]杜海龙.基于解析法的轮式起重机设计计算平台固定副臂部分开发与优化[D].吉林大学,工程力学,2013,硕士.
[20]齐玉洁.桃果实内酯类合成相关的酰基辅酶A氧化酶基因的克隆与表达分析[D].浙江大学,果树学,2012,硕士.
[21]肖瑶.针刺对抑郁大鼠星形胶质细胞谷氨酸功能影响的研究[D].广州中医药大学,针灸推拿学,2014,博士.
[22]宗俊.不同屈服点钢筋混凝土柱耗能性能研究[D].扬州大学,结构工程,2011,硕士.
[23]高传胜,刘志彪.生产者服务与长三角制造业集聚和发展——理论、实证与潜力分析[J].上海经济研究,2005,08:35-42.
[24]武新哲.高中议论文作文教学序列化研究[D].河北师范大学,学科教学,2012,硕士.
[25]王广松.脱机汉字签名鉴别研究[D].华侨大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[26]黄莉莉.多标签学习中特征选择和分类问题的研究[D].安徽大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[27]杨花花.CO_2直接甲酯化负载型催化剂制备及其过程强化[D].重庆大学,化学,2014,硕士.
[28]杨力.机场航显系统中消息中间件设计与实现[D].西安电子科技大学,计算机技术,2010,硕士.
[29]张浩.纯弯荷载作用下抗扭加劲肋对梁腹板局部稳定性的影响[D].西安建筑科技大学,结构工程,2013,硕士.
[30]李佳,林燕,李准洁,李正,梁勇.C_(60)/Cu~(2+)影响质粒DNA构象的复合效应研究[J].江汉大学学报(自然科学版),2012,05:80-84.
[31]姚永革.壬基酚对大鼠F1子代脑早期发育整体基因表达水平影响的研究[D].重庆医科大学,流行病与卫生统计学,2004,硕士.
[32]刘伟,陈学华,贺振华,张固澜,唐湘蓉,蔡涵鹏,高刚.基于倾角数据体的神经网络气烟囱识别[J].石油地球物理勘探,2012,06:937-944+1024+840-841.
[33]陈征.部分斜拉桥动力特性及地震响应分析[D].大连理工大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[34]孙晓丽.30天耐穿试验对羽毛球鞋舒适性的影响[D].湖北大学,运动人体科学,2011,硕士.
[35]记者王宙洁.“超级纤维”横空入市[N].上海证券报,2013-05-23F06.
[36]胡荣.《长江文艺》研究[D].湖北大学,中国现当代文学,2012,硕士.
[37]郝晓丽.论《红楼梦》宴会描写[D].河北大学,中国古代文学,2003,硕士.
[38]刘晓莉.网络购物互动性、感知价值与顾客满意的关系研究[D].浙江工商大学,企业管理,2014,硕士.
[39]李敬社,张小木,黄泽贵.数据挖掘技术的方法和最新进展[J].现代电子技术,2004,22:54-56+64.
[40]董萍.基于重复区域的图像仿射不变特征分析及其应用[D].北方工业大学,应用数学,2014,硕士.
[41]邬盛昌.PDT联合冷冻对肺腺癌杀伤作用的研究及机制初探[D].第二军医大学,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[42]李妍妍.论艺术中的“高峰体验”[D].曲阜师范大学,文艺学,2004,硕士.
[43]杨晓龙.镍黄铁矿和黄铜矿微生物浸出差异性研究[D].北京有色金属研究总院,矿物加工工程,2013,硕士.
[44]纪芳芳.马克思主义生态文明观与当代社会生态系统问题研究[D].山西师范大学,马克思主义基本原理,2014,硕士.
[45]何真.基于财务报告舞弊揭示的存货项目审计研究[D].浙江工商大学,会计（专业学位）,2014,硕士.
[46]欧阳文.基于Gabor小波的人脸识别方法及应用[D].兰州理工大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[47]孙健伟.学科竞赛对研究生创新能力的影响研究[D].南昌大学,高等教育学（专业学位）,2012,硕士.
[48]黄文强.企业人力资源成本控制问题研究[D].中共江苏省委党校,企业管理,2013,硕士.
[49]聂振娟.武汉市地税局信息管税应用研究[D].华中师范大学,公共管理学,2013,硕士.
[50]刘春朝.遥控型推耙机液压控制技术研究及应用[D].大连理工大学,动力工程,2003,硕士.