爱尔卡因和加替沙星对人角膜基质细胞的凋亡诱导作用研究

【摘要】由于人们在现代生活节奏下不规律的作息和对电子产品的过度依赖，眼科疾病的发病率近年来呈爆发的趋势。爱尔卡因和加替沙星分别是眼科常用的局部麻醉剂和抗菌药物，在眼科围手术期经常配合使用。随着其应用的普及，其对患者的毒副作用的影响也日益显现，人们普遍开始关注这两种药物的毒副作用。角膜基质层位于整个角膜结构的中间位置，是一层结缔组织，占据整个角膜厚度的90%。其独特结构很大程度上决定了角膜的性质和功能。本文利用实验室自主建立的非转染、无致瘤性的人角膜基质细胞系为实验材料，通过光学显微镜观察、MTT细胞活力检测、AO/EB荧光双染色、提取DNA的琼脂糖凝胶电泳、透射电镜观察、流式细胞仪检测、ELISA实验等手段观察并研究了爱尔卡因和加替沙星这两种药物对体外培养的人角膜基质细胞的影响，并进一步研究其毒性机理，为这两种药物在临床上的安全使用提供参考。将爱尔卡因从临床浓度5g/L开始倍比稀释用于实验，实验结果显示0.078125g/L~5g/L浓度的爱尔卡因能引起HCS细胞形态结构的变化，如皱缩变圆、空泡化、脱壁死亡等，其中5g/L和2.5g/L的毒性作用极强。MTT检测表明，0.625g/L~5g/L浓度的爱尔卡因处理HCS细胞后，细胞的比活力显著降低，说明这一浓度范围对HCS细胞的毒性作用较强。荧光双染色结果表明0.078125g/L~5g/L浓度的爱尔卡因会不同程度地提高HCS细胞的质膜通透性，尤其0.625g/L~5g/L的爱尔卡因对HCS细胞影响很大，所有这些影响都有时间和浓度的依赖性。1%琼脂糖凝胶电泳验证了0.625g/L和1.25g/L爱尔卡因能引起HCS细胞发生DNA断片化。用1.25g/L的爱尔卡因处理的HCS细胞的超微结构变化显示，细胞出现了胞质空泡化、染色质凝缩、凋亡小体形成等结构变化，这与发生凋亡的细胞的超微结构变化一致，说明爱尔卡因能诱导HCS细胞发生凋亡。凋亡时相检测结果表明，1.25g/L爱尔卡因处理HCS细胞的16h内，细胞经历了正常-早期凋亡-晚期凋亡的不同时相。1.25g/L爱尔卡因处理HCS细胞后，细胞周期发生停滞，停留在G1期。1.25g/L爱尔卡因处理HCS细胞后6h内，细胞的线粒体膜电位显著降低。1.25g/L爱尔卡因处理HCS细胞后，caspase-9首先被激活，激活的caspase-9进一步激活caspase-3，表明爱尔卡因处理后的HCS细胞可能发生了线粒体参与介导的细胞凋亡，但还有待进一步的研究。加替沙星的实验结果显示0.375g/L~3g/L的加替沙星会引起HCS细胞形态结构的变化，如皱缩变圆、空泡化、脱壁死亡等，其中1.5g/L~3g/L的毒性作用较大。MTT检测表明，0.375g/L~3g/L浓度的加替沙星处理HCS细胞后，细胞的比活力显著降低，说明这一浓度范围对HCS细胞的毒性作用较强。0.375g/L~3g/L浓度的加替沙星会不同程度地提高HCS细胞的质膜通透性，尤其1.5g/L和3g/L的加替沙星对HCS细胞影响很大，所有这些影响都有时间和浓度的依赖性。1%琼脂糖凝胶电泳验证了0.75g/L和1.5g/L替沙星能引起HCS细胞发生DNA断片化。用1.5g/L的加替沙星处理的HCS细胞的超微结构变化显示，细胞出现了胞质空泡化、染色质凝缩、凋亡小体形成等结构变化，这与发生凋亡的细胞的超微结构变化一致，说明加替沙星诱导HCS细胞发生凋亡。凋亡时相检测结果表明，1.5g/L加替沙星处理HCS细胞的12h内，细胞经历了正常-早期凋亡-晚期凋亡的不同时相变化。1.5g/L加替沙星处理HCS细胞后，细胞周期发生停滞，停留在G1期。1.5g/L加替沙星处理HCS细胞后6h内，细胞的线粒体膜电位显著降低。1.5g/L加替沙星处理HCS细胞后，caspase-9首先被激活，激活的caspase-9进一步激活caspase-3，表明加替沙星处理后的HCS细胞可能发生了线粒体参与介导的细胞凋亡，但还有待进一步的研究。本文证实了临床使用浓度的爱尔卡因和加替沙星对角膜基质细胞具有极强的毒性，因此临床上对着两种药物的使用应该更加谨慎，尽量降低其使用浓度和使用频率。同时作为一种评价眼科药物毒性的高效简便的材料，体外培养的HCS细胞可以为新型眼科药物的研发提供体外实验依据。
【作者】隋云龙；
【导师】樊廷俊；
【作者基本信息】中国海洋大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】爱尔卡因；加替沙星；细胞凋亡；人角膜基质细胞；流式细胞术；

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