Zfp3612在胚胎早期发育中的表达模式及功能研究

【摘要】RNA结合蛋白是一类对mRNA代谢具有重要调控作用的蛋白,包括控制靶调控RNA的合成、核质运输、亚细胞定位、翻译和RNA的降解等。CCCH串联锌指蛋白家族是RNA结合蛋白中的一个家族,这个家族的成员都含有串联锌指结构。Zfp3612是这个家族中的成员之一,含有CCCH串联锌指保守结构域。小鼠中已有的研究表明Zfp3612可能与造血功能有关。但Zfp3612在早期发育中的作用却并不明确。本研究中我们选择适合早期发育研究的模式生物斑马鱼,初步研究了Zfp3612的序列特征、系统进化以及在早期发育中的功能,探讨了可能的机制,并构建了用于Talen敲除Zfp3612的载体。斑马鱼Zfp3612编码一个长度为373个氨基酸的蛋白质。这比NCBI上预测的Zfp3612编码的蛋白质要多63个氨基酸,明显小于比哺乳动物的Zfp3612蛋白质,分子量大小为41.6kDa,等电点为7.978。该蛋白没有信号肽,共有三个功能域,一个Tis11BN功能域,另外还有两个串联的CCCH锌指结构域。羧基端有富含丝氨酸/脯氨酸的区域。同源序列比对显示哺乳动物的Zfp3612蛋白的同源性极高,高达92%以上,而两栖类及斑马鱼Zfp3612与哺乳动物的同源性则低得多,原因之一是蛋白质的大小差异较大。尽管克隆到的斑马鱼Zfp3612基因编码的蛋白质明显小于人和小鼠的Zfp3612,但共线性分析表明该基因与小鼠和人类的Zfp3612有很好的共线性,这从基因座位的角度说明该基因确实是Zfp3612的直线同源基因。系统进化分析表明Zfp36的所有家族成员都由共同的祖先基因进化而来,Zfp36,Zfp3611,Zfp3612,Zfp3613各自聚为一枝,而且Zfp36,Zfp3611、Zfp3612的分化在硬骨鱼之前就已形成。Zfp3612并没有组织表达特异性,在检测的眼睛、脑、肠、肝脏、鳃、肌肉、心脏和皮肤中均有表达,但在各个不同组织中的表达水平并不均一,在脑、肝脏、心脏中表达较强,而在鳃和肌肉中的表达最少。RT-PCR检测Zfp3612在不同发育时期的表达模式,其在检测的所有发育时期均有较高表达。说明Zfp3612可能在整个发育早期均执行一定的功能。原位杂交结果显示在检测的各个胚胎发育时期Zfp3612均有表达,Zfp3612有很强的母源性表达。之后随着发育的进行,在整个胚胎仍旧有表达。到了胚胎发育的晚期,Zfp3612的表达仍旧没有表达特异性,但很明显的是,其在脑上的表达高于其他部位。Zfp3612与Zfp3611a的表达并不相同,说明Zfp36家族基因可能执行不同的功能。基因敲降/敲除是很好的研究基因功能的方法。Morpholino反义寡核苷酸抑制Zfp3612的mRNA翻译成蛋白质,起到基因敲降的作用。敲降Zfp3612导致了体轴出现问题,出现了类似于背部化的表型,提示Zfp3612可能在胚胎体轴形成中起重要作用。Zfp3612对不同信号通路的影响实验表明Zfp3612可以抑制β-catenin激活的Wnt报告基因。结合报告基因实验和敲降胚胎出现的表型,推测Zfp3612可能是通过调控经典Wnt/β-catenin信号通路的某个成员从而调节体轴形成,但其具体作用机制并不明确。有待于进一步研究。用于Talen敲除Zfp3612的载体也已构建,以用于后续研究。本论文鉴定了影响体轴形成的新基因-Zfp3612,对其特性、在早期发育的功能以及可能的作用机理进行了初步研究。本研究将对完善体轴形成的基因网络体系有一定意义。
【作者】于洋；
【导师】张士璀；
【作者基本信息】中国海洋大学，发育生物学，2013，硕士
【关键词】斑马鱼；早期发育；Zfp3612；表达；功能；

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